大豆GmMYB130对GmCHI3基因的转录调控研究

李洋洋, 朱成敏, 黄盈盈, 赵沁怡, 黄东平, 徐淼泽, 皮二旭

(杭州师范大学生命与环境科学学院,浙江 杭州 310036)

大豆GmMYB130对GmCHI3基因的转录调控研究

李洋洋, 朱成敏, 黄盈盈, 赵沁怡, 黄东平, 徐淼泽, 皮二旭

(杭州师范大学生命与环境科学学院,浙江 杭州 310036)

盐胁迫通常会引起植物细胞内过氧化物等次级危害,是限制农作物产量的主要逆境之一,从分子水平解析大豆在盐胁迫中的响应机制可为大豆耐盐品种的分子育种奠定基础.本研究通过亚细胞定位、染色质免疫共沉淀、荧光定量PCR等手段,探索大豆耐盐响应因子GmMYB130对GmCHI3基因的转录调控机制.结果表明,GmMYB130定位于细胞核中,且能结合于类黄酮合成酶基因GmCHI3的启动子区,从而调节GmCHI3的转录表达.因此,转录因子GmMYB130可能通过激活GmCHI3的转录,调节类黄酮物质的合成,最终提高大豆耐盐能力.

大豆；盐胁迫；GmMYB130；GmCHI3；类黄酮合成

土壤盐渍化严重影响植物生长,是限制作物产量的主要非生物逆境因子之一[1].研究表明,土壤中盐胁迫主要通过Na+对植物造成损伤,其直接损害体现在两个方面：离子毒害与渗透胁迫[2-3].Na+进入细胞后引起过氧化物的积累,过量的活性氧化物会损害蛋白质、核酸以及其它大分子的结构与功能,甚至导致细胞死亡[4].

为抵御盐胁迫引起的过氧化物危害,植物在进化过程中形成了一系列清除活性氧的机制,主要包括酶促和非酶促两类体系.酶促系统包括超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase, APX)等[5],非酶类抗氧化剂主要是一些小分子量的有机物,包括抗坏血酸、谷胱甘肽、甘露醇以及黄酮类等[6-8].

类黄酮是含多酚结构的次生代谢产物,在植物抵御各种逆境胁迫的响应中扮演着非常重要的角色.在黄酮类生物合成过程中,MYB转录因子起关键调控作用,可以调控合成途径中关键酶基因的表达,进而调节黄酮类物质的合成途经[9].

黄酮类代谢途径中分枝众多,有些MYB转录因子能特异地调控某一分枝的代谢,也有一些MYB转录因子调控多个支路的代谢过程.Stracke等对拟南芥幼苗中MYB11、MYB12和MYB111的研究发现,这3个高度同源的MYB类转录因子均可调控查尔酮合酶、查尔酮异构酶(CHI)以及黄烷酮3-羟化酶(Flavanone 3-hydroxylase, F3H)等黄酮类合成途径关键酶的表达,且其作用器官分别为根、子叶等[10].Miyake等发现,MYB101通过调控查尔酮合酶表达水平影响黄酮类物质代谢途径,进而调节豆科植物百脉根和大豆的缺氮响应[11].可见,黄酮类代谢途径关键酶基因的表达通常受MYB类转录因子的调控,负责对多种生物/非生物胁迫信号的响应.

本研究确立GmMYB130转录激活因子角色,并验证其对下游靶基因GmCHI3的转录表达调控,为类黄酮物质主导的植物耐盐响应机制研究奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材料

大豆Union85140种子由中国农科院作物品种资源研究所邱丽娟研究员惠赠.大豆栽培所用珍珠岩和蛭石购于浙江国美园艺有限公司.微生物培养所用LB培养基购于生工生物工程(上海)有限公司.

1.2 方法

1.2.1 过表达载体构建

首先采用高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase(Takara, code No. R045Q)将GmMYB130的基因组片段从Union85140大豆幼苗根中扩增出来.所用引物MYB130OE-F(CATGCCATGGGAAAAACAGCATTAACACAAATAAACTAG)和MYB130OE-R(CATGCCATGGAATGCCACTTATCTAAGTTTAATTTTTAC)涵盖GmMYB130起始密码子上游-1.2 kb UTR到终止密码子.然后,将扩增片段连入T载体.经SacⅠ和KpnⅠ双酶切将GmMYB130基因构入改造后的pDL28载体(含双HA标签和红色荧光标记RFP)[12]的35S启动子3′端即获得植物表达载体pDL28-HA-GmMYB130-RFP.

1.2.2 基因沉默载体构建

采用Oligoengine Workstation 2软件筛选GmMYB130基因的沉默片段.设计引物(MYB130RNAi-1F:AAGAACCTACTACCATCCACCAAAA; MYB130RNAi-1R:CCTCCCTTCCAGGAGTAACAGG; MYB130RNAi-2F:AAGAACCTACTACCATCCACCAAAA; MYB130RNAi-2R: CCTCCCTTCCAGGAGTAACAGG)从pDL28-HA-GmMYB130-RFP载体中扩增这些沉默片段,分别以XbaI/XbaI和KpnI/EcoRⅠ两对酶将沉默片段以相反方向构入pKANNIBAL载体的PDK intron两端,即构成pKANNIBAL-RNAi-GmMYB130中间载体.然后,用限制酶SalⅠ和SpeⅠ将pKANNIBAL-RNAi-GmMYB130的功能片段切下,并连接到表达载体pDL28-HA-RFP中,即得GmMYB130基因的植物沉默载体pDL28-HA-RNAiMYB130-RFP.

1.2.3 农杆菌k599介导的大豆毛根转化

将20 μg的pDL28-HA-GmMYB130-RFP或pDL28-HA-RNAiMYB130-RFP质粒通过冻融法转化到发根农杆菌K599中,通过含卡那霉素的LB平板培养基筛选后,采用PCR方式挑选阳性转化克隆.在30 ℃培养箱中,将该克隆在含卡那霉素的LB平板上划线培养,备用.

同时,将大豆种子在无菌的湿润滤纸上萌发.待根长至1 cm长度,切去下胚轴,保留上胚轴部分.然后,用刀片划伤子叶节部位使之与上述划线培养的K599农杆菌接触.将农杆菌侵染过的大豆子叶置于FM培养基上,在黑暗环境中培养3～5 d.待子叶节处不定根达1 cm长度时,采用体式荧光显微镜筛选显红色荧光的阳性转基因根进行后续试验.

1.2.4 GmMYB130亚细胞定位

用Nikon SMZ1270i体视显微镜筛选GmMYB130-RFP过表达的阳性转基因根.依照文献[13]中方法,采用Carl Zeiss LSM 710激光共聚焦显微镜分析GmMYB130的亚细胞定位.

1.2.5 基因表达量分析

取0.1 g鲜样于液氮中研磨,用超纯RNA提取试剂盒(康为世纪, CW0597S)提取总RNA.取3 μg RNA通过试剂盒(康为世纪, CW2569M)反转录成cDNA.将cDNA模板稀释10倍,进行荧光定量PCR分析(BioRad, CFX96).采用Primer Blast在线软件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计引物GmCHI3RT-F (CTGCTCCGGTGGAGAAGTTT)和GmCHI3RT-R(GAGGAAGACACCGCACTTGA).

1.2.6 染色质免疫共沉淀分析

染色质免疫共沉淀实验设计与操作步骤参考Wu等方法[5]. 简言之, 将GmMYB130与HA标签融合, 构入pDL28载体, 以发根农杆菌k599介导转入大豆根. 然后, 以HA抗体沉淀GmMYB130-HA以及与之结合的DNA复合物, 设计引物(GmCHI3CHIP-1F:CCCTTAACCATTATCATAGATGG; GmCHI3CHIP-1R:CATAAATAGTTTTGTTGCACGTAG;GmCHI3CHIP-2F:GGGTATATGGCTAAAGGATTTGAC;GmCHI3CHIP-2R:GTATTTCACTATTTTGTAGTCTTATTTGC;GmCHI3CHIP-3F:GTTTATAGATGGGTCGGTACAAT;GmCHI3CHIP-3R:GAATAACAATGTAACATTTAAATGGT), 检测该复合物中是否含有GmCHI3启动子区特异的MYB识别基序片段.

2 结果与分析

大豆中MYB转录因子家族由Du等依照生物信息学方法进行命名[14].其中,大部分GmMYB尚无功能方面的研究报道.因而,GmMYB130是否为一个真实的转录因子仍需试验数据支撑.一般而言,转录因子必须符合以下3个条件：1)该蛋白质在细胞核中分布；2)该蛋白质可以结合于下游靶基因的启动子区；3)该蛋白对下游靶基因的转录表达有直接调控作用.

2.1 GmMYB130亚细胞定位

本研究将GmMYB173与RFP编码序列融合于植物表达载体pDL28中,以发根农杆菌介导大豆毛根转化.用体式荧光显微镜筛选出阳性转基因根(图1A,1B),然后通过激光共聚焦显微镜检测GmMYB130蛋白的亚细胞定位.结果显示,GmMYB130-RFP融合蛋白主要分布于细胞核内(图1C).

A: 明场观测大豆根; B: 红色荧光下检测大豆阳性根; C: GmMYB130蛋白亚细胞定位检测.图1 GmMYB130亚细胞定位Fig. 1 Subcellular localization for GmMYB130

2.2 GmMYB130对GmCHI3基因的转录表达调控

GmMYB130和GmCHI3蛋白均为课题组前期研究中发现的大豆根部耐盐关键因子[15].课题组通过生物信息学方法发现,GmCHI3基因启动子区含有3个MYB识别基序(图2A).随后,通过染色质免疫共沉淀法发现,GmMYB130转录因子可与GmCHI3基因启动子区P2和P3位点特异性结合(图2B).

为进一步分析GmMYB130蛋白对GmCHI3基因转录表达水平的影响,课题组构建了pDL28-GmMYB130RNAi沉默和过表达载体,并以发根农杆菌K599介导转入大豆根部,分别获得GmMYB130敲低(GmMYB130-KD)和过表达的大豆根(GmMYB130-OE).通过荧光定量PCR检测,发现GmMYB130-KD根中GmCHI3表达量显著低于空白对照(EV),而GmMYB130-OE根中GmCHI3表达量显著高于EV(图2C).

综合上述结果,转录因子GmMYB130可以直接调控类黄酮合成途径中关键基因GmCHI3的转录表达.

B,C中以转入pDL28-HA空载体(empty vector, EV)的大豆根作为阴性对照.图2 转录因子GmMYB130对GmCHI3基因的转录调控Fig. 2 Transcriptional regulation of GmMYB130 on GmCHI3

3 结论

MYB转录因子调控类黄酮物质合成途径中关键酶基因的表达,进而调节黄酮类物质的合成途经[9].在前期研究的基础上,本研究验证了大豆耐盐相应蛋白GmMYB130的转录因子角色,并且探索了其对耐盐基因GmCHI3的正向转录调控作用.基于上述结果,课题组推测大豆耐盐相应关键蛋白GmMYB130和GmCHI3可能通过调节类黄酮物质合成途径来改善大豆耐盐能力,是对非生物胁迫信号的一种响应[11].后续可通过代谢组学研究手段深入挖掘大豆耐盐相关的小分子物质,找到一些关键的类黄酮物质,进而从代谢水平揭示其耐盐机制.

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Transcriptional Regulation of GmMYB130 onGmCHI3

LI Yangyang, ZHU Chengmin, HUANG Yingying, ZHAO Qinyi, HUANG Dongping,XU Miaoze, PI Erxu

(College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)

Salt stress, usually brings osmotic stress to plant cells, is one of the most abiotic stresses limiting crop productivities. Understanding of the intracellular responses to salinity will favor the molecular breeding of salt tolerant soybean cultivars. In this study, subcellular localization, ChIP and qRT-PCR assays are used to explore the transcriptional regulation ofGmCHI3 by the salt responsive GmMYB130 protein. The results show that GmMYB130 localizes in the nucleus of soybean roots. Interestingly, GmMYB130 bounds to the promoter region of theGmCHI3 gene and activates its transcription. Hence, the transcription factor GmMYB130 is supposed to enhance the soybean tolerance via the regulation of flavonoid synthesis.

soybean; salt stress; GmMYB130;GmCHI3; flavonoid synthesis

10.3969/j.issn.1674-232X.2017.03.008

2016-12-12

国家自然科学基金项目(31301053)；浙江省自然科学基金项目(LY17C020015)；杭州市科技发展计划项目(20170432B01)；杭州师范大学科研启动经费(PF14002004014)；杭州师范大学"三个五"重点培育工程；杭州师范大学实验室开放立项项目；"星光计划"大学生创新项目；"本科生创新能力提升工程"项目；杭州师范大学第17届"挑战杯"大学生课外科学技术作品竞赛项目.

皮二旭(1983—),男,副教授,博士,主要从事植物逆境响应机制研究.E-mail:20130014@hznu.edu.cn

Q344+.14

A

1674-232X(2017)03-0268-05