S100A4、VEGF在非小细胞肺癌中的表达及其相关性的研究

曹睿杰 张玲 周敏 官兵 钟杉 洪玉萍

S100A4、VEGF在非小细胞肺癌中的表达及其相关性的研究

曹睿杰1张玲3周敏1官兵2钟杉1洪玉萍2

目的 探讨S100A4、VEGF在非小细胞肺癌中的表达，分析与临床因素的关系，探讨其临床意义及两者的相关性。方法 收集非小细胞肺癌病例，免疫组化检测非小细胞肺癌及其转移淋巴结组织中S100A4和VEGF的表达，通过图像分析进行定量分析；分析S100A4和VEGF的表达与临床病理的关系，研究S100A4在非小细胞肺癌血管生成中与VEGF表达的相关性。结果 肺鳞癌、腺癌标本及其相关的转移淋巴结中S100A4、VEGF的表达的强度显著高于癌旁组织(P<0.05)。S100A4、VEGF在肺鳞癌、腺癌的表达中均与TNM分期有关(P<0.05)；与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤分化程度无关(P>0.05)。VEGF与S100A4在非小细胞肺癌的表达中呈正相关(P<0.05)。结论 S100A4、VEGF参与了非小细胞肺癌的发生、发展和转移，两者在肿瘤血管生成中有协同作用。

S100A4；VEGF；非小细胞肺癌；免疫组化

随着环境及生活方式的改变，肺癌的发病和死亡率逐年升高，已位居所有癌症发病率和死亡率之首[1]。其中超过80%的肺癌是非小细胞肺癌。到目前为止肺癌的发病机制尚不明确。随着人类基因密码的探索，对基因的研究也逐渐深入，学者们发现在肿瘤的发生、发展及转移过程的各阶段都有基因的参与。如P53、EGFR、VEGF等对肿瘤的发生、发展的影响已经逐渐被发现，基因研究及肺癌的靶向治疗也是当前非小细胞肺癌治疗的热点。S100A4蛋白在非小细胞肺癌中的高表达也已经被人们发现，有研究显示S100A4蛋白与非小细胞肺癌的发病及转移有关[2]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前被认为是作用最强、特异性最高的血管生成调控因子,在非小细胞肺癌的新生血管的形成中起关键作用,并与肿瘤的浸润、转移有关[3]。本研究通过收集我院近年来胸外科手术并经病理证实的非小细胞肺癌组织蜡块标本，采用免疫组化法检测非小细胞肺癌组织及其转移淋巴结组织中S100A4和VEGF的表达，通过图像分析进行定量分析；进一步分析二者在病理分类、分级、TNM分期中的差异性，分析S100A4 和VEGF的表达与临床病理的关系，研究S100A4在非小细胞肺癌肿瘤血管生成中的作用与VEGF表达的相关性，探讨S100A4是否与VEGF在非小细胞肺癌的过程中发挥协同作用。

资料与方法

一、一般资料

收集2010年1月至2014年12月上海六院金山分院手术切除并病理证实为NSCLC伴有淋巴结转移的病例60例。60例患者中鳞癌28例(A组)，腺癌32例(B组)(见表1)。

表1 一般资料

二、试剂

一抗：兔抗人S100A4、VEGF单克隆抗体，二抗：标记长臂生物素的山羊抗兔IgG(以上试剂均采购于武汉博士德生物有限公司)。

三、方法

1 病理切片的制备及免疫组织化学染色：由病理科医生制作切片，根据试剂附带的流程操作，一抗为S100A4、VEGF抗体，二抗为生物素化山羊抗兔IgG。

2 免疫组化判断与图像分析：以细胞浆出现棕黄色颗粒者为阳性。图像分析：置切片于显微镜下，随机选取完整而不重叠的视野进行观察并拍摄照片，用Image-Pro Plus 6.0软件分析每个视野的S100A4、VEGF积累光密度值(IOD值)等。以切片的IOD均值作为表达强度的参考值，以大于癌旁组织x(—)±2s为阳性判断标准。

结 果

一、免疫组化结果

1 S100A4免疫组化下可见鳞癌细胞的胞浆中有少量淡黄色的染色颗粒；腺癌癌细胞的胞浆中可见棕黄色的染色颗粒(见图1)。Image-Pro Plus 6.0软件分析图像后提示，肺鳞癌、腺癌标本及其相关的转移淋巴结中S100A4表达的强度显著高于癌旁组织(P<0.05)(见表2)。

2 VEGF免疫组化下鳞癌细胞胞浆有淡黄色着色，腺癌癌细胞胞浆着色明显(见图2)。Image-Pro Plus 6.0软件分析图像后提示，肺鳞癌、腺癌标本及其相关的转移淋巴结中VEGF表达的强度显著高于癌旁组织(P<0.05)(P<0.05)(见表3)。

图1-1鳞癌 S100A4 图1-2腺癌 S100A4 图1-3 鳞癌淋巴结S100A4 图1-4 腺癌淋巴结S100A4 图2-1 鳞癌VEGF 图2-2 腺癌VEGF 图2-3 鳞癌淋巴结VEGF 图2-4 腺癌淋巴结VEGF

表2 S100A4的表达结果分析

表3 VEGF表达结果分析

二、与NSCLC的临床因素的相关性

S100A4、VEGF在肺鳞癌、腺癌的表达中均与TNM分期有关(P<0.05)；与年龄、性别、分化程度、肿瘤大小无关(P>0.05)(见表4、5)。

三、S100A4、VEGF在非小细胞肺癌表达的相关性

表4 S100A4、VEGF与鳞癌临床特征的关系

表5 S100A4、VEGF与腺癌临床特征的关系

表6 S100A4与VEGF表达的相关性(Pearson系数)

讨 论

肺癌的发病机制复杂，许多环节仍模糊不清，但血管生成在肺癌的发生和转移中的重要性已经得到学者的共识。相关动物实验通过抑制肺癌血管生成可明显抑制肿瘤的发展，目前也已有上市的抑制肺癌血管生成的相关基因药物如吉非替尼、厄洛替尼、克唑替尼等在晚期NSCLC部分人群展示了不错的治疗效果，成功改善病人的生活质量，但适合人群仍极为有限。肺癌血管生成的具体过程尚未明确揭示，参与的基因也未彻底揭秘，为了更多的肺癌病人能得到有效的基因靶向治疗，需要更多的研究及试验来引导新型基因药物的研发。

VEGF是目前已知的作用最强的促血管生成因子之一。多项研究证实在NSCLC组织中VEGF的高表达及其在血管生成中的作用[4]。VEGF可直接并特异与血管内皮细胞上VEGF受体结合并可以产生增加微血管通透性、促进基底膜降解和调节促血管生成相关的基因的表达等效应[5]；抑制VEGF在肿瘤中的表达可明显抑制肺癌血管形成、减少肿瘤体积及提高裸鼠的生存时间[6]。此次试验通过免疫组化发现在NSCLC及其相应的转移淋巴结中均有着显著的VEGF表达的上调，考虑VEGF的促血管形成作用在NSCLC的发生、发展及转移中发挥着重要的作用，与上述研究的结论也是相符合的。

S100蛋白家族也是一个与肿瘤密切相关的蛋白质家族, 只在脊椎动物中表达，其家族中有多个成员与肿瘤的发病有关。S100A4蛋白在许多正常人体组织细胞中也有表达，但在NSCLC[2]等肿瘤细胞却发现了S100A4明显的高表达。S100A4蛋白与NSCLC的关系也逐渐引起学者的重视。有研究证实S100A4过度表达时能促进肿瘤转移的进程[7]。通过对鳞状细胞癌病理切片进行免疫组化分析发现S100A4蛋白的高表达与患者术后病理的分期、淋巴结转移有关[8]。日本学者[9]研究发现S100A4在各种不同病理类型的肺癌中都有S100A4的过度表达，而通过抑制NSCLC细胞中S100A4的表达后可明显降低肿瘤细胞的增殖速度及侵袭能力，考虑S100A4蛋白可通过调节肿瘤细胞增殖来促进肺癌发展。与本次研究结果是相符合的。

肿瘤的生长关键在于肿瘤细胞的增殖及血管的生成，目前对于VEGF的研究较多，VEGF在各系统肿瘤中的作用也被学者们逐渐发现，在NSCLC中VEGF表达的上调及血管生成作用已经达到共识，本次研究通过免疫组化发现VEGF在肺鳞癌、腺癌的表达中均与TNM分期有关(P<0.05)；与年龄、性别、分化程度、肿瘤大小无关(P>0.05)。证实了VEGF通过血管生成参与NSCLC的发生及转移。S100A4在肺癌中的高表达及其对NSCLC转移中的作用也引起学者的兴趣，有研究证实了S100A4在NSCLC表达的上调及在TNM分期、淋巴结转移的差异是有意义的，推测S100A4在NSCLC的发生及转移中发挥作用。推测 S100A4蛋白作为一个促血管发生因子，可通过增强内皮细胞的移动性、减少血管生成抑制因子的产生而促进血管的生成，促进肿瘤的生长和远处转移[10]。本实验通过图像分析软件检测结果提示S100A4与VEGF在NSCLC中均有着显著的高表达，且其高表达呈正相关，两者均有促血管生成作用，故推测两者在肿瘤血管生成中有协调作用。

已有研究证实VEGF及S100A4在胰腺癌中的血管生成作用，但S100A4与VEGF在NSCLC中的表达的相关性的研究尚未见报道，本次研究发现在NSCLC中VEGF及S100A4均有着显著的高表达，且两者的表达呈正相关，故推测S100A4与VEGF在NSCLC的肿瘤血管生成有发挥协同作用，同时沉默VEGF及S100A4可能会更有效的抑制肿瘤血管的生成，可能是成为肺癌治疗的新策略。

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Correlation analysis of the expression of S100A4 and VEGF in non-small cell lung cancer tissues

CAORui-jie,ZHANGLing,ZHOUMin,GUANBing,ZHONGShan,HONGYu-ping
DepartmentofRespiratoryMedicine,JinshanBranchoftheSixthPeople’sHospitalofShanghai,Shanghai201500,China

Objective To investigate the expression of S100A4 and VEGF in non-small cell lung cancer tissues, and to analyze the correlation with clinical factors. Methods NSCLC cases were collected and the expression of S100A4 and VEGF in NSCLC and metastasis lymphnode tissues were detected by immunohistochemical method respectively, and the difference were done by Image-Pro Plus 6.0 image analysis software. The relationship of S100A4 and VEGF with clinical factors were further analyzed, and the correlation between the tumor angiogenesis of them in NSCLC was analyzed. Results The expression of S100A4 and VEGF proteins in lung squamous cell carcinomas, adenocarcinomas and metastasis lymphnode tissues were significantly higher than in adjacent no-malignant tissues (P<0.05). The expression of S100A4 and VEGF were significantly correlated with TNM stages (P<0.05), and not related with gender, age, tumor size and pathological grade (P>0.05). The expression of VEGF in NSCLC had significant relationship with S100A4 (P<0.05). Conclusion S100A4 and VEGF may play a role in the carcinogenesis, development and metastasis of the non-small cell lung cancer. Both of them have synergistic effect on tumor formation.

S100A4 protein; vascular endothelial growth factor; non-small cell lung cancer; immunohistochemical

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.07.010

上海市金山区卫计委青年科研项目(No JSKJ-KTQN-2014-16)

201500 上海，上海市第六人民医院金山分院1.呼吸科，2.病理科 3. 201501 上海,上海市金山区众人老年护理医院内科

周敏，E-mail:zhoumin-1209@163.com

2017-02-27]