莪术石油醚提取物对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231转移相关基因影响的体外研究

钱 祥 甄宏德 李永峰 张爱琴，3

莪术石油醚提取物对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231转移相关基因影响的体外研究

钱 祥1甄宏德2李永峰1张爱琴1，3

目的观察莪术石油醚提取物（PECZ）对三阴性乳腺癌细胞增殖、细胞趋化因子及黏附因子的影响，观察其对三阴性乳腺癌细胞转移相关基因的甲基化作用。方法以三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231作为研究对象，采用CCK-8法检测药物对细胞株的增殖抑制作用，RT-PCR法检测药物对黏附因子E-cadherin、E-selectin和趋化因子SDF-1、CXCR4 mRNA表达量的影响，MSHRM法检测药物对黏附因子E-cadherin的启动子甲基化水平的影响。结果（1）与空白对照组零抑制率比较，不同浓度的表阿霉素组（抑制率为47.2%～68.8%）及PECZ组（抑制率为23.8%～80.2%）对细胞增殖均有一定的抑制作用，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。（2）与空白对照组趋化因子和黏附因子的（1±0）表达量比较，300μg/mL浓度的PECZ干预细胞24h后，细胞趋化因子CXCR4 mRNA（0.63±0.07）的表达降低，趋化因子SDF-1 mRNA（1.13±0.21）和细胞黏附因子E-selectin mRNA（2.73±1.92）表达提高，并显著提高细胞黏附因子E-cadherin mRNA（13.35±3.43）的表达，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。（3）与空白对照组、低剂量PECZ组100%甲基化率比较，高剂量PECZ组甲基化率为80%～90%，明显降低乳腺癌细胞黏附因子E-cadherin启动子的甲基化水平（P＜0.05）。结论莪术石油醚提取物对乳腺癌细胞具有一定的抑制作用，其对细胞转移和侵袭的抑制作用可能是通过上调细胞黏附因子E-cadherin mRNA的表达实现。高浓度莪术石油醚提取物对乳腺癌细胞黏附因子E-cadherin抑癌基因的启动子具有一定的去甲基化作用。

三阴性乳腺癌细胞；莪术石油醚提取物；甲基化；细胞转移

乳腺癌是女性最常见恶性肿瘤之一，其每年发病率和死亡率居我国女性恶性肿瘤的首位[1]。乳腺癌是一种生物学特征高度异质性的恶性肿瘤，雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和HER-2表达在免疫组化上均不表达者，称之为三阴性乳腺癌（TNBC）。TNBC较非TNBC者，具有组织学分级高、恶性程度高、复发率高、总生存期短等特点。对于乳腺癌复发转移，中医多从毒、从痰、从瘀论治，祛痰化瘀散结解毒中药对抑制乳腺癌的复发转移有较好效果[2]。因此，临床治疗乳腺癌复发转移，较多选择具有祛痰化瘀解毒的抗癌中药，如蛇六谷、莪术、制南星、山海螺等。莪术属姜科类植物，为温郁金的干燥根茎，其主要的功效为活血化瘀、行气止痛、破血消癥，常被应用到乳腺癌的治疗[3]。从提取的工艺来分类，莪术提取物包括莪术石油醚提取物（PECZ）、莪术乙酸乙酯提取物（EACZ）、莪术正丁醇提取物（NBCZ）以及莪术水提取物。已有研究[4]显示，不同莪术提取物对乳腺癌均有一定的抑制作用，其中PECZ抑制作用最强。国内动物实验结果显示，莪术抗癌作用的机制与影响细胞增殖[5]、促进肿瘤细胞凋亡[6]、调控端粒酶酶活性[7]和抑制血管生成[8]等有关。本实验通过观察莪术石油醚提取物对三阴性乳腺癌细胞E—cadherin基因启动子的甲基化作用，进一步探讨莪术抗乳腺癌转移的作用机制。

1 实验材料

1.1 试剂与药品RPMI-1640培养基内含15%的小牛血清和10μg/mL人胰岛素；消化液（0.25%胰酶和0.02%EDTA按1：1混合）；碘化丙啶溶液、二甲基亚砜（DMSO）为SIGMA公司产品；PBS液；MS-HRM检测试剂SsoFast Eva Green Supermix（饱和染料qPCR试剂）购自Bio-Rad公司；甲基化标准品EpiTect PCR Control DNA Set（100）Cat.No-59695；SuperScript反转录酶及其缓冲液（GibcoBRL）；TaqDNA聚合酶及其缓冲液（Roche）；dNTP（Roche）；莪术由浙江省肿瘤医院中药房提供（华东医药有限公司）；表阿霉素10mg（浙江海正药业股份有限公司）。

1.2 实验器材电热恒温水槽（DKB-8A型，上海精密实验设备有限公司）、离心机（LDZ5-2型）、CO2培养箱（Heraeus，B5660-EK）、显微镜（OLMPUS）、吸管、超净台、35mL培养瓶、CCK-8 Kit（细胞计数CCK8试剂盒）为日本DOJINDO公司产品；细胞/组织基因组DNA提取试剂盒：GK0221，上海捷瑞生物科技有限公司；RNA/DNA核酸定量仪（Pharmacia-Biotech USA）；实时荧光PCR仪器LightCycler（Roche）及配套软件；OD值测量仪器（高精度分光光度计）为Merinton SMA4000；定量PCR仪为CFX connect Real-Time PCR System，配套使用的分析软件为Precision Melt Analysis（用于HRM分析）；相关耗材（Tip头、EP管等）。

1.3 实验细胞人三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231由浙江省肿瘤研究所惠赠。用15%胎牛血清和100U/mL青霉素、100g/mL链霉素、2mmol/L L-谷氨酰胺的RPMI1640培养液，在37℃细胞培养箱培养备用。

2 方法

2.1 细胞培养细胞用含15%小牛血清（LOT批号1418110）、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素和10μg/ mL胰蛋白酶-EDTA消化液（LOT批号20150414）的RPMI-1640培养基于35mL的培养瓶中进行传代培养。培养条件为37℃，5%CO2，90%相对湿度。

2.2 细胞收集将培养瓶中的细胞按常规方法消化收集细胞，1000r/min下离心5min，弃上清液，加入PBS液洗一遍，细胞株制成1×106/mL的细胞悬液。

2.3 莪术石油醚提取物及表阿霉素的制备与配制精密称取干燥的莪术饮片40g，粉碎成粗颗粒，70%乙醇浸泡过夜后热回流提取2次。2次提取液合并减压浓缩，回收乙醇至无醇后以石油醚萃取，回收萃取物。提取成分过滤除菌，浓缩至浸膏，按极性得到莪术石油醚提取物。精密称取提取物5mg，溶解于500μL二甲基亚砜中，旋涡震荡，待全部溶解后，0.22μm过滤器过滤，少量分装后－20℃保存，其浓度均为10mg/mL。临用前用培养液稀释至所需浓度。表阿霉素（10mg每支）溶于5mL注射用灭菌用水，其终浓度为2mg/mL，临用前配制，4℃保存。

2.4 CCK－8法检测莪术石油醚提取物对细胞增殖作用的影响取对数生长期细胞，以RPMI－1640培养液稀释至浓度约1×104/mL，接种于96孔板，200μL/孔。常规培养24h后，分别加入100、200、300和400μg/mL莪术石油醚提取物，同时设空白对照组和表阿霉素阳性对照组，表阿霉素浓度分别为0.25、0.5、1和2μg/mL。每浓度设3个复孔，于37℃饱和湿度培养箱中继续培养24h后，每孔加入CCK8 10μL（5mg/mL），继续孵育2～4h。用酶标仪在450nm波长处测其吸光度值（OD值）。细胞生长抑制率=（空白组平均值-药物组平均吸光度值）/（空白组平均值-培养液组平均吸光度值）×100%。

2.5 流式细胞仪检测莪术石油醚提取物对细胞趋化因子及黏附因子的影响收集对数生长期MDAMB-231细胞，分4份等量传代于10mL培养瓶，常规培养24h后，换用单纯RPMI-1640培养，将配置好的莪术石油醚提取物加入其终浓度为300μg/mL，并设生理盐水作为阴性对照，设表阿霉素为阳性对照组，浓度为0.25μg/mL，常规培养24h。在药物作用24h后直接用TRIzoI收集细胞备用。采用TRIzol—步法提取total RNA。

PCR扩增，扩增引物如下：

2.6 甲基化实验流程收集对数生长期MDA-MB-231细胞，分别分3份等量传代于10mL培养瓶，常规培养24h后，换用单纯RPMI-1640培养，将配置好的莪术石油醚提取物加入其终浓度为300μg/mL（高剂量组）、100μg/mL（低剂量组），并设生理盐水作为阴性对照，常规培养24h，在药物作用24h后直接用TRIzoI收集细胞备用。通过引物预实验，筛选最佳序列；确定（CDKN2A_296F+CDKN2A_296R）引物对检测p16启动子甲基化水平。

PCR扩增反应体系：SsoFast Eva Green Supermix 10μL，Forward primer，10μM 1μL，Reverse primer，10μM 1μL，ddH2O 6μL，Template 1μL。

qPCR实验参数：98.0°C for 2:00；98.0°C for 0: 02；57.0°C for 0:05 Plate Read；GOTO 2,35 more times；Melt Curve 65°C to 95°C:Increment 0.2°C for 0:05Plate Read

2.7 统计学方法所有数据输入计算机，应用SPSS 16.0统计软件分析处理，每组OD值以（x±s） 表示，多个样本单因素方差分析（q检验）。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 莪术石油醚提取物对细胞体外增殖的影响与空白对照组比较，表阿霉素组、莪术石油醚提取物各浓度组对MDA-MB-231细胞生长均有明显抑制作用，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。见表1，图1～4（插页）。

表1 各组MDA-MB-231细胞体外增殖抑制率比较（x±s）

3.2 莪术石油醚提取物对细胞趋化因子及黏附因子的影响RT-PCR实验结果表明，与空白对照组比较，300μg/mL浓度的莪术石油醚提取物作用24h后细胞，其可降低细胞趋化因子CXCR4 mRNA表达（P＜0.05），提高趋化因子SDF-1 mRNA和细胞黏附因子E-selectin mRNA表达（P＜0.05），并显著提高细胞黏附因子E-cadherin mRNA表达（P＜0.01）。与表阿霉素组比较，莪术石油醚提取物组E-cadherin mRNA显著上调（P＜0.05），说明莪术石油醚提取物组对MDA-MB-231细胞转移和侵袭的抑制作用可能源于对E-cadherin mRNA的调控。见表2，图5（插页）。

表2 各组细胞趋化因子SDF-1、CXCR4和黏附因子E-cadherin、E-selectin mRNA表达比较（x±s）

3.3 莪术石油醚提取物对细胞黏附因子E-cadherin基因启动子的甲基化作用空白对照组和低剂量药物组样本的CDH1启动子（E-cadherin基因）甲基化程度为100%，即E-cadherin基因启动子完全不表达；高剂量药物组的3个样本CDH1启动子甲基化程度80%～90%，即E-cadherin基因启动子出现去甲基化现象。见图6～8（插页）。

4 讨论

TNBC侵袭性强，易出现复发转移，是预后最差的一种特殊乳腺癌类型。因此，降低乳腺癌细胞侵袭转移是治疗的重中之重。Gould Rothberg等[9]研究表明，乳腺癌中上皮型钙黏素（E-cadherin）的表达下降与肿瘤转移相关。

肿瘤属中医“癥瘕”、“积聚”范畴，莪术具有活血化瘀、破血消症的功效。本实验结果表明，PECZ能显著提高细胞黏附因子E-cadherin mRNA表达，其对乳腺癌细胞转移和侵袭的抑制作用可能源于其对E-cadherin mRNA的调控作用。

肿瘤DNA异常甲基化包括抑癌基因启动子区的高甲基化及某些癌基因启动子区的低甲基化，前者占甲基化异常的大多数，指基因启动子区CpG岛的异常甲基化致使许多抑癌基因沉默而失活。研究表明，抑癌基因启动子异常甲基化在人类多种肿瘤包括鼻咽癌、肺癌、肝癌、胃癌、肠癌、乳腺癌等的发病过程中起到重要作用。多种抑癌基因包括P16、E-cadherin、RASSF1A和BRCA1等已被证实由启动子高甲基化致其沉默，参与肿瘤发生发展的多种生物学过程，如DNA修复、细胞周期、细胞黏附、细胞凋亡和血管生成。E-cadherin是一种重要的细胞一细胞间黏附分子，E-cad表达降低的肿瘤更易发生侵袭和转移。相关研究表明，细胞黏附因子E-cadherin基因（CDHl启动子）5’区CpG岛甲基化可出现在乳腺癌细胞中，且这种甲基化在一定条件下是可逆的[10]。本实验通过甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析空白对照组、低剂量药物组、高剂量药物组中乳腺癌细胞E-cadherin基因（CDHl启动子）甲基化的差异，结果显示空白对照组和低剂量药物组样本的CDH1启动子甲基化程度为100%，即E-cadherin基因启动子完全不表达；而高剂量药物组CDH1启动子甲基化程度低于100%，即E-cadherin基因启动子出现去甲基化现象。我们进一步推测莪术石油醚提取物作用于三阴性乳腺癌细胞后，E-cadherin基因启动子出现去甲基化作用，E-cadherin mRNA部分表达，抑制细胞侵袭与转移。本研究结果显示，莪术石油醚提取物对细胞中CDH1启动子具有一定的去甲基化作用，但此结果仅仅是其抗肿瘤机制中的冰山一角，启动子异常甲基化可使肿瘤细胞中多种信号通路紊乱。例如上皮黏附因子E-cadherin可与β-catenin结合，抑制其聚集在核内而影响β-catenin影响细胞内定位，致Wnt/β-catnin信号通路异常活化。对于多条信号通路以及相关信号因子的传递仍有待进一步探索。

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［2］孙霃平，刘胜，刘玲琳.浅论中医从化理论及其在乳腺癌转移治疗中的应用［J］.上海中医药大学学报，2010，24（2）：25-27.

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（收稿：2016-10-27修回：2017-01-19）

Effect of Petroleum Ether Extracts of Curcuma Zedoaria on Metastasis-associated Genes of Triple Negative Breast Cancer Cells in vitro

QIAN Xiang1,ZHEN Hongde2,LI Yongfeng1,ZHANG Aiqin1,3
1 Department of Chinese Medicine Medical Center,Zhejiang Cancer Hospital,Hangzhou(310022)；2 Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053);3 Zhejiang Integrative Oncology Key Laboratory,Hangzhou(310022)

ObjectiveTo investigate the effect of petroleum ether extract of Curcuma zedoaria（PECZ）on proliferation,chemokines,and adhesion factors in triple negative breast cancer cell MDA-MB-231.MethodsMDAMB-231 cells were treated with various concentrations of PECZ;cellular viability was detected with CCK-8 method, the mRNA expressions of E-cadherin,E-selectin and SDF-1,CXCR4 with RT-PCR,and the methylation of E-cadherin promoter with MS-HRM analyses.ResultsCompared with the blank control group,MDA-MB-231 cells were inhibited by PECZ（the inhibitory rate were from 23.8%-80.2%）and epirubicin（the inhibitory rate were from 47.2%-68.8%）,with P＜0.05;the CXCR4 mRNA expression level was decreased at 24h after treated with PECZ at the concentration of 300μg/mL and the mRNA expressions of E-cadherin,E-selectin and SDF-1 were increased（P＜0.05 or P＜0.01）.Compared with the blank control group and low-dose group（100μg/mL）,high-dose（300μg/ mL）PECZ reduced the level of methylation on E-cadherin promoter to 80%-90%（P＜0.05）.ConclusionPECZ can inhibit the proliferation,metastasis and invasion of breast cancer cells possibly by upregulating the expression of E-cadherin mRNA.In methylation level,PECZ has some demethylation function on E-cadherin promoter.

triple negative breast cancer cell;petroleum ether extracts of curcuma zedoaria;methylation;cellmetastasis

浙江省中医药科技计划项目（No.2016ZA034、2016ZB023）

1浙江省肿瘤医院名中医馆（杭州310022）；2浙江中医药大学（杭州310053）；3浙江省中西医结合肿瘤重点实验室（杭州310022）

张爱琴，Tel：0571-88122245；E-mail：zhanghaojianbb@163.com