复方酸枣仁颗粒质量标准研究

吴琼　胡北　李想

[摘要] 目的 对复方酸枣仁颗粒的质量标准进行研究。 方法 采用薄层色谱法（TLC）对制剂中的酸枣仁、知母、甘草三味药材进行专属性鉴别；采用高效液相色谱法（HPLC）对处方中药材知母的有效成分芒果苷进行含量测定。色谱柱为Welchrom C18 HPLC Column（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流动相为甲醇-乙腈-0.5%的乙酸水（7∶7∶86），检测波长为258 nm，进样量为10 μL，流速为1.0 mL/min，柱温为30℃。 结果 酸枣仁、知母、甘草三味药材的TLC特征斑点清晰，分离度好，阴性没有干扰。芒果苷在1.072～167.5 μg/mL的浓度范围内呈良好的线性关系，回归方程为Y=42 888X-30 400，r = 0.999 9。平均加样回收率为99.15%，RSD=2.82%（n = 6）。3批样品中芒果苷的含量分别为0.1690、0.2473、0.2735 mg/g，符合要求。 结论 所建立的质量标准准确、重复性良好，可用于復方酸枣仁颗粒的质量控制。

[关键词] 复方酸枣仁颗粒；芒果苷；高效液相色谱法；薄层色谱法；质量控制

[中图分类号] R927 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）05（c）-0144-05

[Abstract] Objective To establish the quality standard for Fufang Suanzaoren Granules. Methods Ziziphi spinosae semen， Anemarrhenae rhizome， Glycyrrhizae radix et rhizoma were identified by TLC. The contents of mangiferin were determined by HPLC. HPLC method on mangiferin was adopted on a Welchrom C18 （4.6 mm×200 mm， 5 μm） column with Methanol-acetonitrile-0.5% acetic acid （7∶7∶86） as the mobile phase， the flow rate was 1.0 mL/min， the detection wavelength was 258 nm， the column temperature was 30℃ and the injection volum was 10 μL. Results TLC spots of Ziziphi spinosae semen， Anemarrhenae rhizome， Glycyrrhizae radix et rhizoma were clear with good resolution and without interference of negative samples. There was a good linearity within the range of 1.072-167.5 μg/mL， with the linear equation of Y=42 888X-30 400， r = 0.999 9. The average recovery of berberine hydrochloride was 99.15% and the RSD was 2.82% （n = 6）. The content of Mangiferin in three batchs samples were satisfactory. Conclusion The method is simple， accurate and reproducible. It can be used as the quality control method of Fufang Suanzaoren Granules.

[Key words] Fufang Suanzaoren Granules； Mangiferin； HPLC； TLC； Quality standard

复方酸枣仁颗粒含有川芎、知母、酸枣仁、甘草、茯苓五味中药，具有养肝血，安心神，调血养肝，清热除烦的功效，用于治疗虚劳烦不得眠、心悸、盗汗、头晕目眩、咽干口燥、脉弦或细数所致的心烦失眠等症，临床应用中疗效确切，效果较好。复方酸枣仁颗粒是由沈阳军区总医院（以下简称“我院”）生产的，根据总后勤部卫生部下发的“军队医疗机构制剂标准提高计划”中对医院制剂标准研究项目的提高的要求，对复方酸枣仁颗粒的质量标准进行了再提高和进一步完善[1]。复方酸枣仁颗粒中的知母是我国传统的中药材，性苦、甘、寒，有清热泻火，滋阴润燥之功效[2]。复方酸枣仁颗粒的原制剂质量标准中没有含量测定项，为了提高制剂的质量，应用薄层色谱法（TLC）对复方酸枣仁颗粒中的酸枣仁、知母、甘草三味药材展开了专属性鉴别，同时应用高效液相色谱法（HPLC）测定了知母的有效成分芒果苷的含量。

1 仪器与试药

AUW120D型分析天平（日本岛津公司）；KQ3200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率150 W，频率40 kHz）；W600型Waters高效液相色谱仪（2996型紫外检测器）；硅胶G薄层板（青岛海洋化工有限公司）；芒果苷对照品（中国药品生物制品检定研究院，供含量测定用，批号为：111607-201503）；甘草苷对照品（中国药品生物制品检定研究院，批号为：111610-201106）；知母对照药材（中国药品生物制品检定研究院，批号为：1070-200002）；酸枣仁对照药材（中国药品生物制品检定研究院，批号为：121517-201103）；复方酸枣仁颗粒（我院，批号分别为：20151008、20151212、20151215）；自制的知母、酸枣仁、甘草阴性样品各1批；乙醇（沈阳市苏家屯区辽河化工厂）；甲醇（色谱纯，Fisher公司）；乙腈（色谱纯，Sigma公司）；乙酸（天津市恒兴化学试剂制造有限公司）；水为重蒸水；其他试剂均为分析纯。

2 方法與结果

2.1 薄层鉴别实验

2.1.1 酸枣仁药材的薄层色谱鉴别 取复方酸枣仁颗粒20 g，研细，置圆底烧瓶中，加甲醇100 mL，加热回流1 h，将其滤过，并将其滤液蒸干，残渣加水15 mL使之溶解，之后用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15 mL，合并正丁醇提取液，用氨水洗涤2次，每次用量10 mL，并将洗液弃去，将正丁醇液用水浴蒸干，用1 mL甲醇溶解残渣，将此溶液作为复方酸枣仁颗粒的供试品溶液[2-6]。另取酸枣仁对照药材2 g，加入甲醇30 mL，依供试品溶液制法制成对照药材溶液[2-6]。照TLC试验，吸取上述供试品溶液及对照药材溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶5）的上层为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，置于105℃加热至斑点清晰[7-8]。供试品色谱中，在与酸枣仁对照药材色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点；在阴性样品色谱中于相应的位置上无干扰（图1）。

2.1.2 知母薄层鉴别 取本品8 g，研细，置圆底烧瓶中，加乙醇40 mL，盐酸1 mL，加热回流1.5 h，放冷，滤过，取续滤液，加水10 mL，加甲苯振摇提取2次，每次20 mL，过滤后合并甲苯溶液，将其水浴蒸干，加入1 mL甲醇溶解残渣，将此溶液作为复方酸枣仁颗粒的供试品溶液[2-3]。另取知母对照药材0.5 g，同供试品溶液制法制成对照药材溶液。照TLC试验，吸取上述供试品溶液及对照药材溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-丙酮（7∶3）为展开剂，展开，取出，晾干。喷以5%香草醛硫酸溶液，置于105℃加热至斑点清晰[9-10]。供试品色谱中，在与知母对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；在阴性对照样品色谱中于相应的位置上无干扰（图2）。

2.1.3 甘草薄层鉴别 取复方酸枣仁颗粒16 g，研细，加入甲醇30 mL，超声处理40 min，滤过，将滤液置于水浴蒸干，加入1 mL甲醇使溶解，作为供试品溶液。另取甘草苷对照品，加甲醇，制成1 mg/mL的甘草苷溶液，作为对照品溶液[2-3]。照TLC试验，吸取上述供试品溶液及对照品溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-乙酸-水（10∶1∶1∶2）为展开剂，展开，取出，晾干。喷以10%硫酸乙醇溶液，置于105℃加热至斑点清晰[11-12]。供试品色谱中，在与对照品相应的位置上，显相同颜色的斑点；在阴性样品色谱中于相应的位置上无干扰（图3）。

2.2 芒果苷含量的测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Welchrom C18（4.6 mm×200 mm， 5 μm）；流动相：甲醇-乙腈-0.5%的乙酸水（7∶7∶86）；流速：1.0 mL/min；检测波长为258 nm，柱温为30℃，进样量为10 μL。理论塔板数按芒果苷计算应不低于3000[2-3，13-16]。

2.2.2 对照品溶液的制备 取适量芒果苷对照品，精密称定，加入流动相使溶解，制成每毫升含芒果苷10 μg的溶液，作为对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液及阴性供试品溶液的制备 取复方酸枣仁颗粒，研细，取约5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入25 mL的70%乙醇，密塞后，称定其重量，超声处理30 min，取出，放冷，再称定其重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀后，滤过，量取续滤液2 mL，置于10 mL容量瓶中，用流动相溶液稀释至刻度，摇匀，即得[17-18]。

另取缺少知母的阴性样品颗粒，按供试品溶液制备的处理方法进行处理，制得阴性样品溶液。进样前经0.45 μm微孔滤膜过滤。

2.2.4 专属性试验 取“2.2”项下3种溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进行进样测定。精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性供试品溶液各10 μL，于高效液相色谱仪中测定。结果见图4，芒果苷的保留时间约为24 min，阴性样品不干扰芒果苷的方法测定，芒果苷与其他的杂质或成分的分离度>1.5，理论塔板数按芒果苷计算应不低于3000。试验结果表明此方法专属性强。

2.2.5 线性关系考察 精密吸取浓度分别为1.072、3.216、10.72、42.880、167.500 μg/mL的芒果苷对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪中，按“2.2.1”色谱条件分析，测定各对照品的峰面积，以对照品浓度（μg/mL）为横坐标，以峰面积值为纵坐标，进行线性回归，得到回归方程为：Y=42 888X-30 400，r = 0.999 9。结果表明，芒果苷在1.072～167.5 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.6 精密度试验 精密吸取对照品溶液（10 μg/mL）10 μL，连续进针6次进行测定，记录各个色谱峰的峰面积，测得芒果苷峰面积的RSD为1.37%（n = 6）。结果表明，仪器的精密度符合要求。

2.2.7 稳定性试验 取同一批复方酸枣仁颗粒样品（批号：20151212），研细，取约5 g，精密称定，按照“2.2.3”供试品溶液制备的方法进行操作，按“2.2.1”项下的色谱条件进行分析，分别在0、2、4、6、8、10 h进样，测定样品中不同时间段芒果苷的色谱峰峰面积，测得芒果苷峰面积的RSD为2.23%（n = 6）。说明供试品溶液在10 h内稳定性良好。

2.2.8 重复性试验 取同一批颗粒样品（批号：20151212），研细，取约5 g，对其精密称定，按照“2.2.3”供试品溶液制备的方法进行操作，按“2.2.1”项下的色谱条件进行分析，测定每份供试样品中芒果苷的含量[17-18]。结果显示样品中芒果苷的平均含量为0.2581 mg/g，RSD为2.34%（n = 6）。结果表明，本方法的重复性良好，符合要求。

2.2.9 加样回收率试验 取同一批酸枣仁颗粒样品（批号：20151211），研细，取约2.5 g（共6份），精密称定，分别精密加入芒果苷对照品溶液（0.67 mg/mL）1.0 mL，按照“2.2.3”项下供试品溶液制备的方法进行操作，制成供测定回收率用的供试品溶液[17-20]，按“2.2.1”项下的色谱条件分析，测定样品中芒果苷含量，计算加样回收率，结果该样品中芒果苷的平均回收率为99.15%，RSD为2.82%（n = 6）；结果表明，本方法回收率较高。结果见表1。

2.2.10 样品含量测定 取3个批号的复方酸枣仁颗粒样品（批号：20151008、20151212、20151215），按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪中，测定样品中芒果苷的含量，结果见表2。结果3批样品芒果苷的含量分别为0.1690、0.2473、0.2735 mg/g。

3 讨论

3.1 薄层鉴别

本实验中对酸枣仁鉴别所采用的TLC展开剂参考《中国药典》2015年版酸枣仁鉴别项下的相关条件，最终采用正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶5）的上层为展开剂进行展开，结果斑点清晰、阴性无干扰[2-6]。

3.2 含量测定

处方中君药为酸枣仁，依照《中国药典》2015年版一部中规定，选取酸枣仁皂苷A作为含量测定项，但试验过程中发现，酸枣仁皂苷A含量过低，实验条件下无法实现待测物质峰的良好分离。故选择对知母中有效成分芒果苷进行含量测定。

参考《中国药典》芒果苷的含量测定项下流动相的选择，选用甲醇-乙腈-0.5%的乙酸水（10∶5∶85）、甲醇-乙腈-0.5%的乙酸水（8∶8∶84）、甲醇-乙腈-0.5%的乙酸水（7∶7∶86）为流动相作为试验条件进行了考察，待测样品与杂质不能完全分离，阴性样品有干扰，进而调整流动相的比例，最终选择了甲醇-乙腈-0.5%的乙酸水（7∶7∶86）為流动相，待测样品可与杂质可完全分离，阴性样品没有干扰，并取得了较好的峰形和较高的理论塔板数，效果良好[2]。

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（收稿日期：2017-01-30 本文编辑：李亚聪）