山东省辣椒主要病毒种类的分子检测与鉴定

王少立，谭玮萍，杨园园，代惠洁，孙晓辉，乔宁 , ，竺晓平



山东省辣椒主要病毒种类的分子检测与鉴定

王少立1，谭玮萍1，杨园园1，代惠洁2，孙晓辉1，乔宁1, 2，竺晓平1

（1山东农业大学植物保护学院/山东省蔬菜病虫生物学重点实验室，山东泰安 271018；2潍坊科技学院，山东寿光262700）

【目的】鉴定山东省辣椒上的主要病毒种类，明确该地区辣椒上的主要病毒病原。【方法】2014—2015年，在山东省临沂、日照、青岛、烟台、潍坊、淄博、济宁、菏泽、聊城、德州共10个市（区）采集253份疑似感病的辣椒植株叶片，提取叶片总RNA和总DNA，利用双生病毒的通用引物（PA/PB）、马铃薯卷叶病毒属通用引物（POL-F/POL-R）及已报道侵染辣椒的主要病毒的检测引物对样品进行PCR、RT-PCR分子检测与鉴定，将扩增得到的目的条带经凝胶回收试剂盒回收纯化后连接到pMD18-T载体上，再送至公司进行克隆测序。分别将所得的PMMoV、PeVYV和BWYV序列在NCBI上利用BLAST进行检索，利用DNAStar软件中的Megalign将所得序列与GenBank中已登录的世界各地有代表性的序列进行同源性比对，利用软件Mega 5.05的Clustal W法进行多序列比对分析以及邻接法（neighbor-joining，NJ）构建系统进化树，系统进化树中各分支置信度（Bootstrap）进行1 000次重复分析。【结果】 PMMoV、CMV总检出率分别为61.66%、60.08%；TMGMV、BBWV-2、BWYV、TMV发生也比较普遍，检出率为41.90%、34.78%、33.20%和24.90%；PCV-2、ToMV、TYLCV、PVY、MABYV、PeVYV、PCV-1、ChiVMV、AMV发生侵染现象较少，检出率分别为11.86%、9.88%、9.09%、6.72%、5.53%、3.56%、3.16%、0.79%和0.40%；未检测到CaCV、PSV、ChiRSV、TSWV和ToMMV。通过对病毒复合侵染现象进行分析发现，病毒复合侵染率高达89.92%，其中3种病毒复合侵染现象最多，所占比例达28.63%，4种病毒复合侵染率为25.00%，2种病毒复合侵染率为21.77%，5种病毒复合侵染率为13.31%，一个辣椒样品最多可同时感染6种病毒，侵染率为1.21%；对山东省10个地区的辣椒病毒检测，结果表明在辣椒上检出病毒种类最多的为临沂、济宁，检测到12种病毒，其次是烟台、聊城，检测到11种病毒，潍坊、菏泽检测到9种病毒，青岛、德州检测到8种病毒，日照检测到7种病毒，淄博检测到6种病毒，日照地区辣椒病毒复合侵染率最高，为100%，菏泽地区复合侵染率最低，为69.23%。分别根据PMMoV的部分基因序列、PeVYV部分、、基因序列以及BWYV部分、基因序列构建系统发育树，结果表明本研究PMMoV山东分离物SD60与中国贵州分离物的亲缘关系最近，PeVYV山东分离物SDRZ31-1与意大利IT83分离物的亲缘关系最近，BWYV山东分离物SD与韩国分离物LS的亲缘关系最近。【结论】在山东省采集的253份辣椒样品可被15种病毒侵染，PMMoV、CMV为主要病毒种类；在山东新检测到的病毒有MABYV、PeVYV、BWYV、PCV-1和PCV-2；明确了山东省主要辣椒产区病毒病发生情况以及病毒种类的主次关系。

辣椒病毒病；辣椒轻斑驳病毒；甜菜西方黄化病毒；甜瓜蚜传黄化病毒；复合侵染

0 引言

【研究意义】辣椒（）作为一种重要的蔬菜作物，不仅营养价值高，还是重要的调味料。近年来，中国辣椒种植面积不断扩大，年播种面积在150—200万hm2，占全国蔬菜总播种面积的8%—10%，居蔬菜首位[1]。随着辣椒种植规模的逐步扩大，辣椒病毒病也愈发严重，已成为危害辣椒生产中的首要病害，给农民造成巨大的经济损失，制约着辣椒产业的持续发展。山东省是全国6大辣椒主产区之一，种植规模逐年扩大，但是辣椒病毒病的发生也比较普遍，是制约辣椒产量和品质的重要因素。因此，明确山东省辣椒主要病毒种类，对于辣椒病毒病的防控预警具有重要意义。【前人研究进展】国外报道侵染辣椒的病毒达67种[2]，而国内现已鉴定出侵染辣椒的病毒种类有22种。辣椒能被黄瓜花叶病毒（，CMV）、烟草花叶病毒（，TMV）、辣椒轻斑驳病毒（，PMMoV）、辣椒斑驳病毒（，PepMoV）、辣椒脉斑驳病毒（，PVMV）、蚕豆萎蔫病毒（，BBWV）、马铃薯Y病毒（，PVY）、马铃薯X病毒（，PVX）、烟草蚀纹病毒（，TEV）、辣椒环斑病毒（，ChiRSV）、苜蓿花叶病毒（，AMV）、烟草脆裂病毒（，TRV）、番茄斑萎病毒（，TSWV）、花生黄斑病毒（，GYSV）、辣椒褪绿病毒（，CaCV）、番茄花叶病毒（，ToMV）、芜菁花叶病毒（，TuMV）[3-12]、烟草轻型绿花叶病毒（，TMGMV）[13]、辣椒脉斑驳病毒（，ChiVMV）[14-15]等RNA病毒侵染；另外还被番茄黄化曲叶病毒（，TYLCV）、烟草曲茎病毒（，TbCSV）及中国辣椒黄化曲叶病毒（，PYLCCNV）[16-18]等DNA病毒侵染。近几年发现侵染辣椒的病毒还有甜菜西方黄化病毒（，BWYV）[19]、番茄褪绿病毒（，ToCV）[20]。山东省作为重要的辣椒产区，辣椒病毒病发生也比较严重，杨超等[21]对侵染山东辣椒的黄瓜花叶病毒进行了研究，结果表明CMV是山东省辣椒病毒病的主要毒源之一；刘春香等[22]对寿光地区侵染辣椒的TYLCV进行了研究，发现该地区的辣椒TYLCV感染率较高。【本研究切入点】山东是蔬菜大省，设施和露地辣椒种植面积较大，辣椒连作导致病毒病暴发，对辣椒的产量和品质具有重大影响，对辣椒生产的危害日益扩大，目前还缺少对侵染山东地区辣椒的主要病毒种类全面系统的研究，也没有山东省辣椒上病毒复合侵染情况的相关报道。【拟解决的关键问题】明确山东辣椒病毒病病原的具体种类和病毒种类的主次关系，以及是否出现新病毒病害，为针对性地预警和防控提供理论依据。

1 材料与方法

试验于2014—2016年在山东农业大学植物保护学院完成。

1.1 材料

2014—2015年，在山东省的临沂、日照、青岛、烟台、潍坊、淄博、济宁、菏泽、聊城、德州等地共采集花叶、畸形、坏死等疑似感染病毒病的辣椒样品253份，于-20℃冰箱中备用。

植物RNA提取试剂Trizol、DNA聚合酶、dNTPs及植物总RNA、DNA提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；分子量标准Normal Run 250 bp-Ⅱ DNA ladder由上海捷瑞生物技术有限公司提供；凝胶回收试剂盒由AXYGEN生物技术有限公司提供；反转录试剂RNase M-MLV（RNase H-）、Recombinant Rnase Inhibitor由宝生物工程（TaKaRa）有限公司提供；其他生化试剂及普通化学试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 总RNA和DNA提取、RT-PCR和PCR

分别根据试剂盒说明从辣椒样品中提取总RNA、DNA。以辣椒感病叶片总RNA为模板，以各病毒特异性引物的下游引物为反转录引物，使用M-MLV合成病毒cDNA。反转录反应体系（5 μL）：RNA模板1.5 μL，下游引物0.5 μL，Rnase-Free H2O 1.0 μL，70℃变性10 min，立即放置冰上2 min，再加入以下试剂：5×M-MLV Buffer 1.0 μL，dNTP mixture（10 mmol·L-1）0.25 μL，RTase M-MLV（RNase H-）（200 U·μL-1）0.25 μL，RNase Inhibitor（40 U·μL-1）0.125 μL，RNase-Free H2O 0.375 μL，总体积为5 μL。42℃保温60 min，再70℃保温15 min。

PCR反应体系：取上述合成的cDNA或DNA液2 μl，加入2.5 μL 10×EasyTaq Buffer，1 μL dNTPs（2.5 mmol·L-1），上下游引物各1 μL，0.5 μLDNA聚合酶，17 μL ddH2O。扩增条件：94℃3 min后，94℃ 30 s、X℃ 30 s（温度见表1）、72℃ 50 s，共30次循环，最后，72℃10 min。取PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳，检测并拍照。

1.3 PCR产物的回收及测序

将PCR电泳目的条带参照凝胶回收试剂盒说明书进行纯化、克隆，测序由铂尚生物技术（上海）有限公司完成，测序结果提交NCBI核酸数据库进行BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）序列比对。

1.4 PMMoV、PeVYV和BWYV序列分析

从采集的感病样品中分别选取具有代表性PMMoV、辣椒脉黄化病毒（，PeVYV）和BWYV阳性克隆送铂尚生物技术（上海）有限公司测序。分别将所得PMMoV、PeVYV和BWYV序列在NCBI上利用BLAST进行检索，利用DNAStar软件中的Megalign 将所得序列与GenBank中已登录的世界各地有代表性的序列进行同源性比对，利用软件Mega 5.05的Clustal W法进行多序列比对分析以及邻接法（neighbor-joining，NJ）构建系统进化树，系统进化树中各分支置信度（Bootstrap）进行1 000次重复分析。

2 结果

2.1 侵染山东省辣椒的主要病毒种类及检测结果

对采集的253份辣椒样品提取总RNA，利用特异性引物进行RT-PCR扩增，取10 μL扩增产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测分析（图1）。

对采集的辣椒样品进行PCR、RT-PCR检测，结果表明（表2）检出的病毒种类有15种：PMMoV、CMV、TMGMV、BBWV、BWYV、TMV、ToMV、TYLCV、PVY、甜瓜蚜传黄化病毒（，MABYV）、PeVYV、辣椒潜隐病毒1（，PCV-1）、辣椒潜隐病毒2（2，PCV-2）、AMV和ChiVMV，而未检测到CaCV、花生矮化病毒（，PSV）、ChiRSV、TSWV和番茄斑驳花叶病毒（，ToMMV）。有5个样品未检测到病毒，病毒检出率高达98.02%。

表1 山东省辣椒病毒检测所用引物

山东省10个地区的辣椒病毒检测结果表明在辣椒上检出病毒种类最多的地区是临沂、济宁，检测到12种病毒，其次是烟台、聊城，检测到11种病毒，潍坊、菏泽检测到9种病毒，青岛、德州检测到8种病毒，日照检测到7种病毒，淄博检测到6种病毒。

在检出的病毒中（图2），PMMoV与CMV的检出率较高，分别为61.66%、60.08%，可能是危害山东省辣椒的主要病毒；TMGMV、BBWV、BWYV和TMV的侵染现象普遍，总检出率为41.90%、34.78%、33.20%和24.90%；PCV-2、ToMV、TYLCV、PVY、MABYV、CABYV、PeVYV、PCV-1、ChiVMV和AMV的侵染现象较少，检出率分别为9.88%、9.09%、6.72%、5.53%、3.56%、0.79%和0.40%，其中MABYV、PeVYV、BWYV、PCV-1和PCV-2，是山东省最新检测到侵染辣椒的病毒。

表2 山东省辣椒上主要病毒的检测结果

2.2 辣椒上病毒的复合侵染情况

在248份阳性样品中，仅发现25份样品为单一病毒的侵染，其余样品为2种及以上病毒的复合侵染，复合侵染率为89.92%，其中以3种病毒复合侵染所占比例最高，为28.63%，4种病毒复合侵染率为25.00%，2种病毒的复合侵染率为21.77%，5种病毒复合侵染率为13.31%，6种病毒复合侵染率为1.21%。结果表明，山东地区辣椒上病毒复合侵染现象严重。

病毒复合侵染类型由图3可知，2种病毒复合侵染类型主要是CMV+PMMoV，3种病毒复合侵染类型复杂，主要是CMV+BWYV+PMMoV，4种病毒复合侵染类型主要是CMV+PMMoV+BWYV+BBWV，5种病毒复合侵染现象较少，其中CMV+PMMoV+TMGMV+ BBWV+TMV是主要侵染类型，在所有样品中只发现了3个样品为6种病毒复合侵染，侵染类型是CMV+ TMV+ToMV+TMGMV+BWYV+PMMoV、CMV+ TMV+PVY+ToMV+PeVYV+PCV-2、CMV+TMV+ TMGMV+BWYV+ PCV-1+PCV-2。

对山东省主要辣椒产区的复合侵染现象进行分析，发现日照地区辣椒病毒复合侵染率最高，为100%，菏泽地区复合侵染率最低，为69.23%。聊城、德州、济宁、烟台、淄博地区以3种病毒复合侵染为主，潍坊、菏泽地区以4种病毒复合侵染为主，临沂地区以5种病毒复合侵染为主，青岛地区多以4种、5种病毒复合侵染为主，日照地区多为3种、4种、5种病毒复合侵染。

2.3 PMMoV、PeVYV、BWYV系统进化树分析

2.3.1 PMMoV基因序列的系统进化树分析 将PMMoV的基因序列与NCBI上的相应序列进行了比对，并对其进行核苷酸相似性分析，结果表明所得到的分离物与其他序列相似性为94.7%—99.5%，其中与中国贵州分离物（KC571248）相似性最高，为99.5%。所构建的系统进化树也显示，本研究所得的PMMoV山东分离物SD60（KR261606）与中国贵州分离物（KC571248）的亲缘关系最近，聚集在一个进化枝上，并且与核苷酸相似性分析结果相同（图4）。

2.3.2 PeVYV基因序列的系统进化树分析 本研究所获得的PeVYV部分序列（对应基因组2 888—3 843位，共956 bp，NCBI核酸数据库中PeVYV这一段序列登录较多）上传到NCBI核酸数据库中，序列包括部分编码区，并获得了相应的登录号（KR226803）。运用DNAStar的Megalign软件，将本研究所得的PeVYV的序列与世界各地的相关序列进行核苷酸相似性分析，结果表明其与选取序列的核苷酸相似性为94.4%—97.8%，与意大利分离物IT83相似性最高，为97.8%。利用Mega 5.05的NJ法构建系统进化树，如图5所示。本研究所得的PeVYV分离物SDRZ31-1（KR226803）与意大利分离物IT83（KU886193）的亲缘关系最近，聚类在同一分支上，这与核苷酸相似性分析结果一致。

2.3.3 BWYV基因序列的系统进化树分析 由于在NCBI核苷酸数据库中，BWYV的全基因组序列较少，因此本研究选取其中长411 bp的序列（对应基因组3 562—3 972位，NCBI核酸数据库中这一段序列登录较多），包含部分的，将该段序列与世界各地的相应序列进行比对。对BWYV序列进行核苷酸相似性分析，结果表明与选取的国内外序列核苷酸相似性为86.6%—98.5%，与韩国分离物LS（KM076647）相似性最高，为98.5%。为了更好地分析BWYV的进化历程和亲缘关系，选取世界各地有代表性的BWYV序列构建系统进化树。从系统进化树中，可以看出BWYV山东分离物SD与韩国分离物LS（KM076647）的亲缘关系最近，与核苷酸相似性分析结果一致，从而明确了该分离物隶属于BWYV（图6）。

3 讨论

辣椒是一种重要的蔬菜，近年来，中国辣椒的种植面积逐年上升，但受辣椒病毒病的危害日益严重，对辣椒生产造成了重大的经济损失。北京[3]、天津[3,34]、辽宁[3]、江苏[3]、吉林[3]、新疆[3]、重庆[4,20]、陕西[5,13]、四川[8]等地均对辣椒上的病毒种类进行过系统的研究。虽然前人对山东省侵染辣椒的CMV、TYLCV进行过研究，但缺乏对山东省辣椒上的病毒进行全面系统的调查研究。

本研究对山东省辣椒病毒病进行系统的调查与检测，结果表明目前侵染山东省辣椒的病毒种类有15种，病毒检出率较高，且复合侵染现象比较严重。通过对病毒复合侵染现象进行分析发现，其中3种病毒复合侵染现象最多，4种和2种复合侵染的次之，一个辣椒样品最多被6种病毒同时侵染。PMMoV能与CMV、TMV、PVY、ToMV、BBWV、TMGMV、BWYV、PeVYV、MABYV、ChiVMV、TYLCV、PCV-1和PCV-2等病毒发生复合侵染，CMV与TMV、PVY、ToMV、BBWV、PMMoV、TMGMV、BWYV、PeVYV、MABYV、ChiVMV、TYLCV、PCV-1和PCV-2等病毒发生复合侵染，同样地，能与10种以上病毒发生复合侵染病毒的还有TMV、TMGMV、BWYV、BBWV、PCV-2，并且这几种病毒的检出率都比较高，这可能与病毒的传播方式以及辣椒的品种有关。辣椒病毒病的症状多种多样，可能是由多种病毒复合侵染导致的，多种茄科蔬菜的大面积种植、种子土壤带毒以及广泛的传毒媒介等均能导致复合侵染的发生，特别是传毒介体，如CMV、TMV、BBWV、BWYV等病毒均能通过蚜虫进行传播，有的传毒介体能携带传播多种病毒，从而出现一种植物可被多种病毒侵染现象。病毒复合侵染能够导致植物抗性丧失，危害更为严重。此外，本研究发现采集的一些样本疑似感染辣椒病毒，但是在该样本中未检测到病毒，可能是由于植物的一些生理性病害或是药害所致。

本研究中，PMMoV在辣椒上检出率最高，而PeVYV和BWYV是侵染山东辣椒的新记录，由于MABYV、PCV-1、PCV-2在NCBI核酸数据库中登录的序列较少，没有构建系统发育树，因而分别对PMMoV的基因序列、PeVYV的部分基因序列以及BWYV的部分基因序列构建了系统发育树。从进化关系上来说，PMMoV和BWYV在进化上与寄主种类没有关联，可能与地域有一定关系，而PeVYV从进化树上不能得出其与寄主和地域来源有无关联。

MABYV[35]、BWYV、PeVYV[25]、PCV-1和PCV-2是山东省内新发现的侵染辣椒的病毒。MABYV、PeVYV、BWYV同属于黄症病毒科（）马铃薯卷叶病毒属（）成员，通过蚜虫持久性传播。发病植株上主要症状表现为叶脉黄化，严重时整个叶片黄化并向上卷曲，畸形，且发病植株矮化，果实变小。本研究发现，这3种病毒之间复合侵染现象普遍，这与该属病毒能依靠蚜虫进行传播有关。2011年在土耳其和突尼斯等地的辣椒上发现了BWYV[36]，中国于2015年也报道了BWYV能侵染辣椒[18]。本研究在山东省辣椒上也发现了该病毒，且这一病毒的检出率达到了33.2%，其发展已十分普遍，应该引起足够的重视，防止出现这一病毒的大暴发，对这一病毒还需要进一步研究。PCV-1和PCV-2属于双分体病毒科，该科成员在寄主中含量很低，不引起寄主明显的症状，这两种病毒的基因组信息和功能研究较少，还需要进一步研究。

本研究所测到的15种病毒，大多是可以通过蚜虫进行传播，部分病毒通过粉虱进行传播，且研究发现温室种植的辣椒病毒检出率明显低于露天种植的辣椒病毒检出率。目前山东省温室大棚的蚜虫防治初见成效，但大田种植防治蚜虫环节薄弱，使蚜虫量增加并加速了植物病毒的传播，导致病毒危害日益加重。山东省是蔬菜大省，拥有国内先进的工厂化育苗，并销售国内各地，因此要做好辣椒病毒病的相关调查，及时做好相关防治措施，以防止辣椒病毒病的大量暴发和传播，造成经济损失。

4 结论

对采自山东省10个市（区）的253份辣椒样品进行20种病毒的检测，发现目前侵染山东辣椒的病毒种类有15种，其中PMMoV、CMV为主要病毒毒原，病毒检出率均达到了60%以上，并且病毒的复合侵染现象比较严重。新发现了5种侵染山东省辣椒的病毒，分别为PeVYV、BWYV、MABYV、PCV-1和PCV-2。

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（责任编辑 岳梅）

Molecular Detection and Identification of Main Viruses on Pepper in Shandong Province

WANG ShaoLi1, TAN WeiPing1, YANG YuanYuan1, DAI HuiJie2, SUN XiaoHui1, QIAO Ning1,2, ZHU XiaoPing1

(1College of Plant Protection, Shandong Agricultural University/Shandong provincial key laboratory for Biology of Vegetable Diseases and Insect Pests, Taian 271018, Shandong;2WeiFang University of Science and Technology, Shouguang 262700, Shandong)

【Objective】 The objective of this study is to identify the main viruses causing pepper virus diseases in Shandong Province, China.【Method】In 2014-2015, a total of 253 susceptible pepper plant samples were collected from 10 urban areas (Linyi, Rizhao, Qingdao, Yantai, Weifang, Zibo, Jining, Heze, Liaocheng, Dezhou) in Shandong Province. Total RNA and DNA were extracted from the leaves of pepper samples, and were subjected to detect viruses with Geminivirus universal primers (PA/PB), Polerovirus universal primers (POL-F/POL-R) and specific primers of main viruses infecting pepper have been reported by PCR and reverse transcription-PCR (RT-PCR). Each amplified fragment was purified by DNA gel extraction kit, cloned into pMD18-T vector and sequenced. The obtained sequences of PMMoV, PeVYV and BWYV were subjected to BLAST search, and compared with the representative sequences of GenBank which had been registered around the world using the Megalign in DNAStar software. Clustal W method of Mega 5.05 was used for multiple sequence alignment analysis and the phylogenetic tree were constructed by neighbor-joining (NJ) of Mega 5.05, with the bootstrap of each branch of phylogenetic tree analyzed 1 000 times. 【Result】The PMMoV and CMV had the highest detection rate, were 61.66% and 60.08%, respectively. TMGMV, BBWV-2, BWYV and TMV were popular with the detection rate of 41.90%, 34.78%, 33.20% and 24.90%, respectively. The detection rates of PCV-2, ToMV, TYLCV, PVY, MABYV, PeVYV, PCV-1, ChiVMV andAMV were 11.86%, 9.88%, 9.09%, 6.72%, 5.53%, 3.56%, 3.16%, 0.79% and 0.40%, respectively. No CaCV, PSV, ChiRSV, TSWVand ToMMV were detected. The complex infection phenomenon showed that co-infections were up to 89.92%, three kinds of viruses mixed infection occurs the highest rate, up to 28.63%, followed by four kinds of viruses mixed infection, up to 25.00%, two kinds of viruses mixed infection, up to 21.77%, five kinds of viruses mixed infection up to 13.31%, and 6 viruses detected in one sample is the extreme case, with the mixed infection rate up to 1.21%. Phylogenetic trees were constructed with partialof PMMoV, partial,andgenesof PeVYV and partialandgenes of BWYV, respectively. PMMoV Shandong isolate SD60 and the China Guizhou isolate had the closest relationship, PeVYV-SDRZ31-1 and Italy isolate IT83 shared the closest relationship, BWYV Shandong isolate SD clustered with Korean isolate LS. 【Conclusion】 Fifteen viruses were detected, among which PMMoV and CMV were the main pathogens. The newly detected viruses are MABYV, PeVYV, BWYV, MABYV, PCV-1 and PCV-2 in pepper in Shandong Province. The occurrence of viral diseases and the primary and secondary relationship of the main types of pepper viruses in Shandong province were clarified.

pepper virus diseases;(PMMoV);(BWYV);(MABYV); complex infection

2017-01-18；接受日期：2017-03-23

国家公益性行业（农业）科研专项（201303028）、山东省科技发展计划（2014GNC111008）

王少立，E-mail：wangshaolisdau@163.com。通信作者竺晓平，Tel：0538-8247781-8510；E-mail：zhuxp@sdau.edu.cn