电针对去卵巢大鼠骨形成及骨吸收活性的影响

浪万英 王亚军 宋亚文 张来举 宋凯

甘肃中医药大学针灸推拿学院，甘肃 兰州 730000

目前，骨质疏松症的发病率逐年上升，且以其严重的临床症状引起医学界的广泛关注[1-3]。医学界专业研究人员致力于探索有效的治疗方法来攻克这一临床难题，主要通过探索西医西药、中医中药的作用机制，寻求最能缓解患者临床症状，解除病痛的治疗方法。针灸以独特的治疗优势被广大患者接受，能有效缓解患者的症状{4,5]。为此，临床科研人员开始对针灸治疗骨质疏松症的效果及其机理进行研究[6,7]。本文研究了电针刺对去卵巢大鼠的全身骨密度及其骨形成和骨吸收活性进行了研究，为电针刺治疗骨质疏松症的效果及其机理的研究提供帮助。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

电针(上海华谊医用仪器有限公司)；双能X线骨密度测定仪(美国GE公司)；戊酸雌二醇片(拜耳医药保健有限公司，批号：199A3)；兔IgG-免疫组化试剂盒SABC即用型(博士德生物工程有限公司，批号：11C31C SA1022)；OPG(ab183910，批号：GR154990-29)；RANKL(ab9957，批号：GR262704-1)；大鼠成骨细胞专用培养基(武汉普诺赛生命科技有限公司，批号：CM-R091)；PBS液(北京雷根生物技术有限公司，批号：0111/A16)；通用细胞冻存液(北京雷根生物技术有限公司，批号：0111A16)；过氧化物酶阻断液(博士德生物工程有限公司，批号：11C17B08)；DAB显色试剂盒(博士德生物技术有限公司，批号：11B23C22)； 载玻片(中国制造，批号：7105)；显微镜盖玻片(中国制造，批号：10212020C)；针灸针(苏州医疗用品厂，Ф0.35 mm×13 mm)。

1.2 方法

1.2.1骨质疏松症模型大鼠的制备方法：选取SPF级2月龄SD雌性大鼠40只，随机分为空白组、模型组、药物组和电针组，后3组采用手术方法切除双侧卵巢。将大鼠以0.3 mL/100 g的10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，在其最末肋骨下一横指且旁开脊柱有一小的隆起处，并剃去此处鼠毛，铺无菌洞巾，以碘酊消毒。切开皮肤、背部肌肉、腹膜，以小镊子轻轻将白色发亮脂肪团拉出切口外，分离脂肪团，便可见到粉色菜花样卵巢。先将卵巢下端输卵管用丝线结扎，然后摘除卵巢。切口缝合后，对皮，碘酊消毒，同法摘除另一侧卵巢，造成骨质疏松症模型大鼠。造模后饲养13 w，检测骨密度和骨矿物含量。

1.2.2动物分组：空白组：不予任何处理，常规饲养。模型组：灌服与药物组同体积的蒸馏水，常规饲养。药物组：按照1 mL/100 g标准灌胃给予0.02 mg/mL戊酸雌二醇水溶液(大鼠给药剂量按照人与大鼠体表面积比值折算而得)[8,9]，1次/1 d，连续治疗5 d，间隔2 d。20 d1疗程，治疗3疗程。电针组：“三阴交”穴位于后肢内踝尖直上10 mm，直刺5 mm；“足三里”穴位于膝关节下侧，腓骨小头下缘5 mm处，直刺5 mm；“脾俞”穴位于第十一胸椎棘突下旁开1.5寸，直刺5 mm；“肾俞”穴位于第2腰椎棘突下旁开1.5寸，直刺5 mm。以大鼠脚趾中指和同身寸法确定旁开位置和针刺深度剃去背部鼠毛，应用针具及穴位常规消毒后，用30号0.5寸不锈钢毫针快速刺入皮下一定深度，接入电针，频率为2 Hz，断续波[10,12]，刺激强度1.0 mA，以局部见肌肉轻微收缩为佳，每次15 min，同时灌服与药物组同体积的蒸馏水。1次/1 d，连续治疗5 d，间隔2 d。20 d1疗程，治疗3疗程。

1.2.3全身骨密度检测：治疗3个月后，采用腹腔注射10%水合氯醛麻醉各组大鼠。待至大鼠处于全身迷醉状态下(用拇指和食指掐其尾端，如果大鼠没有甩尾动作，显示达到最佳测定时段)，将其依次置于骨密度测定仪器。将大鼠置于测定板上，使四肢，尾部全部集中于测定板上，使头部，躯体和尾部处于测定板的纵端中线上，避免偏移，并使全身处于伸展状态。扫描全身，采用计算机显示大鼠全身骨影像，保存扫描图片，抄录检测数据[13-15]。

1.2.4大鼠成骨细胞的体外培养：将乳鼠置于75%酒精中浸泡处死，无菌条件下取其颅骨并去除骨膜及结缔组织，PBS 清洗3 次； 将骨片剪碎(大小约1 mm×1 mm×1 mm)，转移至培养瓶中，0.25%胰酶消化2 次(37℃，每次10 min)，弃去上清液，0.1% 的Ⅱ型胶原酶消化10 min，弃上清；再用0.1% 的Ⅱ型胶原酶消化4 次(37℃，每次20 min)，收集合并上清液，加入5 mL 含血清的培养基中止酶消化，150 目滤网过滤3次，1 000 r /min 离心10 min；弃上清，加入培养基(α-MEM培养基，内含10% PBS)，吹打均匀并计数。原代细胞悬液以3×104/mL 接种于大皿(Nunc) 中培养，每皿10 mL，37 ℃、5% CO2和饱和湿度的条件下培养，每3 d换液1 次。待细胞铺满80%培养皿后进行爬片培养。

1.2.5成骨细胞的血清处理方法：采用10%水合氯醛(0.03 mL/100 g)麻醉各组大鼠，待大鼠麻醉充分后，用5 mL真空采血针对准心脏部位扎取一定量血清，冷置1 h，离心(2 500 r/min，25 min)，弃去沉淀物，保留上层血清。将上层血清采用56℃水浴灭活30 min，并用0.22 um的滤网抽滤除菌。将各组制备血清依10%的比例加入爬片培养的成骨细胞3 d后，4%多聚甲醛固定10 min。采用免疫细胞化学染色法处理各组细胞爬片，并通过图像分析处理软件选取恰当视野，提取灰度值，结果采用积分光密度(IOD)表示。

1.2.6免疫细胞化学染色方法：各组成骨细胞经4%多聚甲醛固定10 min后，PBS清洗3次(每次3 min)，0.1% Triton X-100透膜10 min，清洗3次后加入30% H2O2灭活内源性过氧化物酶。蒸馏水清洗3次，加入BSA封闭20 min，清洗后加入OPG 和RANKL一抗(1∶500稀释)，4℃过夜处理。PBS清洗3次(每次3 min)，滴加生物素化二抗，37℃孵育20 min，PBS清洗3次(每次3 min)，滴加SABC试剂并37℃孵育20 min，PBS清洗3次(每次3 min)。使用DAB显色后流水清洗，乙醇梯度脱水，树脂封片，拍照采集照片。通过图像分析处理软件选取恰当视野，采用Image-Pro Plus 6.0扫描光密度(IOD)。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠全身骨密度BMD检测结果

如表1所示，与空白组相比，模型组骨密度显著降低(P<0.05)，说明去卵巢骨质疏松大鼠模型建立成功。经过药物或针刺处理后，骨密度显著升高，与模型组相比具有统计学意义(P<0.01)。

2.2 大鼠全身骨矿物含量BMC检测结果

如表2所示，与空白组相比，模型组骨矿物含量显著降低(P<0.05)，说明去卵巢骨质疏松大鼠模型建立成功。经过药物或针刺处理后，骨矿物含量显著升高，与模型组相比具有统计学意义(P<0.01)。

表1 各组大鼠全身BMD比较Table 1 Comparison of the whole body BMD in

注：*与空白组比较，P<0.05，差异具有统计学意义。
**与模型组比较，P<0.01，差异具有统计学意义。

表2 各组大鼠全身BMC含量的比较Table 2 Comparison of the whole body

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，**P<0.01

2.3 大鼠血清处理后成骨细胞OPG蛋白表达结果

如图1、2所示，空白组OPG表达量最高，模型组最低，经过药物或针刺处理后，OPG表达显著升高，与模型组相比具有统计学意义(P<0.01)。

图1 大鼠血清处理后成骨细胞OPG蛋白表达Fig.1 The expression of osteoblasts OPG protein after processing of rat serum

图2 大鼠血清处理后成骨细胞OPG蛋白表达与模型组比较，**P<0.01Fig.2 The expression of osteoblasts OPG protein after processing of rat serum

2.4 大鼠血清处理后成骨细胞RANKL蛋白表达结果

如图3、4所示，空白组RANKL表达量最低，模型组最高，经过药物或针刺处理后，RANKL表达显著下降，与模型组相比具有统计学意义(P<0.01)。

图3 大鼠血清处理后成骨细胞RANKL蛋白表达Fig.3 The expression of osteoblasts RANKL protein after processing of rat serum

图4 大鼠血清处理后成骨细胞RANKL蛋白表达与模型组比较，**P<0.01Fig.4 The expression of osteoblasts RANK protein after processing of rat serum

3 讨论

以往一系列实验[16-18]都对骨质疏松大鼠有关于骨质变化的各项指标进行了详细的研究，结果均表明：针灸在骨质疏松症的预防或是治疗方面均能起到良好改善作用。本实验结果提示：针刺治疗骨质疏松症可能是通过调控成骨细胞内OPG、RANKL蛋白的表达，从而调节OPG-RANKL-RANK信号通路，以此调节破骨细胞骨破坏和成骨细胞骨重建系统的平衡，达到预防和治疗骨质疏松症的效果，亦进一步证实临床上采用针灸治疗多种原因导致的骨质疏松症均能取得良好效果的实践经验。

中医认为，肾主骨生髓，脾主四肢肌肉，肝主筋。如《素问·六节脏象论》记载“肾者,封藏之本,精之处也,其华在发,其充在骨。”可见，肾中精气能够化生为营养物质，润养全身骨骼，保证骨骼的正常生长代谢。同时，肾中精气的后天充养有赖于后天脾胃的不断补充才能延续生命。如《素问·生气通天论》云“是故谨和五味,则骨正筋柔,气血以流,胰理以密,如是则骨气以精,谨道如法,长有天命。”再者，中医理论认为肝气的条达、顺畅有助于脾胃的正常运化，从而腐熟水谷等精微物质，不断补充、滋养先天之脏。如《素问·上古天真论》云“肝气衰则筋不能动”；《经脉别论》曰“食气入胃,散精于肝,淫气于筋”。所以本研究依据动物实验针灸学选取了与肝脾肾三脏联系最为密切的穴位，同时设立阳性药物组与之作对比。研究结果进一步证实了以往研究结果：药物和电针治疗去卵巢大鼠骨质疏松症均能取得疗效，但是单纯电针和药物疗效相比，前者略微较后者好。该研究为针灸学术界再添一项具有说服力的结果，亦能更好地为临床采用针灸推拿治疗骨质疏松症提供事实依据。同时，希望该研究领域的研究人员能更一步深入探索运用针灸骨质疏松症的实质性内容[19-21]。