orexin-1受体抑制剂通过Wnt通路促进骨髓间充质干细胞的成骨分化

张丽媛 纳青青 吴天秀 李近 吴敬开 刘钰瑜

1.广东医科大学解剖学教研室，广东 湛江 524023 2.广东医科大学药理学教研室，广东 湛江 524023

Orexins是神经细胞用来进行相互通讯的一种蛋白，自15多年前德克萨斯大学西南医学中心的研究人员发现Orexins以来，它们被证实调控了许多的行为，包括觉醒、食欲、报偿、能量消耗和失眠[1]。目前对其研究，最为熟知的就是Orexin缺陷可引起发作性睡病——自发性日间嗜睡。因此，orexin拮抗剂有望治疗失眠症，其中默沙东制药公司的suvorexant已经2014年8月被FDA批准上市。

近年来，越来越多的证据显示,神经肽,比如neuromedin U(NMU)和神经肽Y(NPY),可以通过中枢和局部功能调节骨骼内稳态[2]，然而,神经肽orexin是否也能调节骨量还是未知的。在对orexins生理功能的研究过程中，德克萨斯大学西南医学中心的研究人员和日本的同事们一起，发现缺失orexins的小鼠骨骼非常的薄且脆，很容易折断[3]。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一种存在于骨髓内来源广泛、易于扩增、具有多种分化潜能的非造血干细胞，在不同条件下分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、胆道上皮细胞等多种细胞[4-5]。MSCs成骨分化能力下降是骨质疏松症发生的重要原因，Wnt通路是调控骨髓间充质干细胞分化的重要通路。目前国内关于orexin-1系统与骨代谢的报道较少，因此本研究通过探讨Wnt通路对orexin-1受体抑制促进大鼠BMSCs成骨分化的影响，为开发新的治疗骨质疏松症的药物提供新的视点。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1动物

由广东医学院试验动物中心SPF级动物室提供1月龄大鼠10只，雌雄各半，体重70±10g(广东省动物质量合格证：scxk(粤)2004-2008；实验动物环境设施合格证：2008B012)。实验过程动物处理符合医学伦理学标准。

1.1.2药物和试剂

DMEM低糖培养液：Gibco公司；胎牛血清：Hyclone公司；0.25%胰蛋白酶(含EDTA)Sigma公司；美国Gibco公司；BCA蛋白定量试剂盒：Beyotime；Dickkopf-1 Abcam；噻唑蓝(MTT)：美国SIGMA公司；orexin-1受体抑制剂(SB408124):英国TOCRIS公司，批次：S154501；wnt3a购自R&D公司；逆转录试剂盒:Takara公司；PCR试剂盒:Takara公司。

1.1.3仪器

BOXUN 超净工作台：上海博讯实业有限公司医疗设备；2424-2型二氧化碳恒温培养箱：美工SHELLAB公司；XD-101倒置相差显微镜：江南光电股份有限公司；TMQ-R-3250自动台式灭菌器：山东新华医疗器械股份有限公司；流式细胞仪FASC Aria：美国BD公司；超纯水系统：美国Millipore公司；定量光度仪：德国eppendorf公司；定时定量PCR仪：瑞士罗氏公司；电泳仪：BIO-RAD。

1.2 方法

1.2.1细胞收集

采用传代贴壁法分离纯化大鼠骨髓基质干细胞，具体步骤：1月龄SPF级SD大鼠6只，雌雄各半，颈部脱臼后，浸泡于75%酒精10 min，无菌分离大鼠两侧的股骨，75%酒精浸泡，无菌PBS中浸泡，DMEM(L)中浸泡，去除软组织，用8 mL不完全DMEM(L)培养基冲洗骨髓腔，收集冲洗出的细胞液吹打混匀，1000 rmp离心10 min后，弃上清液，沉淀用含10%FBS的DMEM(L)培养液重悬，以1×107/cm2密度接种到25 cm2培养瓶中，置于37℃，5%CO2饱和湿度的培养箱内静置培养，48 h后首次全量换液去除悬浮细胞，此为原代细胞P0，以后每2～3d全量换液一次。

1.2.2大鼠骨髓基质干细胞鉴定

1.2.2.1大鼠骨髓基质干细胞的形态学观察：采用倒置相差显微镜逐日观察细胞的生长情况及一般形态特征。

1.2.2.2流式细胞术对细胞表面标志物的鉴定：取生长状态良好的BMSCsP3细胞，胰酶消化后1000 rmp，10 min离心后弃去上清，加PBS液1000 rmp，10 min重悬三次，制成单细胞悬液，用PBS稀释相应抗体。实验分4组：对照组、CD90-PE组、CD29-FITC组、CD45-PE-CY5组、CD90-PE+CD29-FITC+CD45-PE-CY5组，每组分别加入相应单克隆抗体，30分钟避光孵育后洗涤，免疫荧光法流式细胞仪检测表面抗原。

1.2.3免疫印迹方法检测orexin-1受体抑制剂对Wnt通路主要靶点蛋白的影响

取BMSCsP3细胞消化后，1.5×105/cm2种于6孔板，次日加药，分组：Control、50μg/LWnt3a、1×10-5mol/L orexin-1受体抑制剂、1×10-6mol/L orexin-1受体抑制剂。待测定时间消化细胞，用PBS洗2遍，加入蛋白裂解液，冰上静置15至20 min，每3 min涡旋振荡混匀一次，4℃离心机13200 rpm，15 min，吸取上清液，放于-20℃备用。吸取每孔10 μL的样品加入96孔板，每孔PBS10 μL，每孔100 μL染液，室温静置120 min，用酶标仪在570 nm下检测吸光值。蛋白上样样品制备蛋白样品和5×上样缓冲液按4∶1量配比，将蛋白放置煮沸的水中10 min后，取出备用。将制胶装置组装完成后用超纯水捡漏，将配好的分离胶注入装好的制胶板间，30 min后待分离胶凝固后，加入配制好的浓缩胶，同时将齿梳装好，待浓缩胶凝固后，拔出齿梳，每孔加入25 μL的蛋白上样样品。用80 V电泳3 min后，改用120 V待样品跑至分离胶与浓缩胶交界处改用100 V，100 min，当Maker分层后，电泳至Maker分离至分离胶底部，停止电泳。将胶从板上剥离后，切除浓缩胶，保留分离胶，并放置进已准备好的三文治结构的盒子中，纤维布、滤纸、胶、PVDF膜、滤纸、纤维布，排尽气泡后，装好装置用100V转膜，90 min后停止转膜。取出PVDF膜后，用含封闭液浸泡PVDF膜，室温摇床1小时后，封闭完成。取出PVDF后，加入封闭液稀释一抗(1∶200)，用塑料膜封口后，放于4℃冰箱摇床过夜。取出加入一抗过夜的PVDF膜，放于摇床上一小时复温后，用TBST洗PVDF膜3次，每次5 min后，加入含封闭液稀释二抗(1∶5 000)，放置于塑料封口膜中摇床摇1 h。用TBST洗PVDF膜5次每次5 min，浸泡于TBST中。PVDF膜浸泡发光液中，放入盒子用底片曝光，洗片机显影定影后取出底片。

1.2.4orexin-1受体抑制剂对Wnt通路靶点相关基因表达的影响

取BMSCsP3细胞消化，3×105/cm2种于6孔板，次日加药。分组：Control、50 μg/LWnt3a、1×10-5mol/Lorexin-1受体抑制剂、1×10-6mol/L oreixn-1受体抑制剂。每3天更换新鲜的培养液和药物，放进孵箱继续培养。用药物处理BMSCs5天后，弃去培养液和药物，用PBS润洗3次弃去PBS后，将Trizol加入板内，裂解细胞后，收集液体。每1 mL的Trizol加入200 μL的氯仿，剧烈混匀15 s，室温下静置2 min，4℃，12000 rpm离心15 min，取上层上清液，加入等体积异丙醇，静置10 min，4℃，12000 rpm离心10 min，弃去上清，加入75%DEPC水配制的乙醇，混匀后7000 rpm，4℃离心5 min，弃去乙醇溶液，室温下风干10 min，加入适量DEPC水溶解RNA，-20℃备用。2 μLRNA样品加入适量的稀释液，混匀后转入比色杯。用稀释液调零，将样本管放入定量光度仪，在260 nm处读取OD值。OD值×倍数，即得RNA浓度(μg/μL)，在280nm处测OD值，计算OD260/OD280(1.7<比值<2.1的样本用于PCR反应)。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠骨髓基质干细胞形态

刚分离的BMSCs，呈球形，悬浮于培养液中，与骨髓中的其他杂细胞相混，不能很好被辨认。培养24 h后细胞开始贴壁，呈圆形发亮，48 h后首次全量换液，显微镜观察可见小部分贴壁展开细胞，呈不规则生长，细胞形态为短条状或圆形，出现一些团簇集落。4到5天后贴壁细胞数量增多，并逐渐长出伪足，呈梭形、三角形或扁平形，先形成不同大小分散小集落，胞浆丰富，胞核大且清晰。7到9天后，细胞达到融合生长，集落间融合，细胞形态较均一，细胞呈梭形，此时进行首次传代。胰酶消化时，细胞逐渐收缩，把吹打下来的细胞重新种回培养瓶中，细胞重新贴壁展开，经过2～3次传代换液后，细胞形态基本均一，呈均匀有序的长梭形。见图1。

图1 传四代大鼠骨髓基质干细胞培养3d时的细胞形态(×100倍)Fig.1 Micrographs of the fourth passage BMSCs at 3d(×100)

2.2 流式细胞术鉴定大鼠骨髓基质干细胞表面抗原

收集BMSCsP3进行CD29-PE，CD90-FITC，CD45-FITC荧光染色，流式细胞检测结果如图2所示：从第三代开始，BMSCs表面抗原CD29表达阳性，阳性细胞率>99%(图2K、N、Q)；CD90表达阳性，阳性细胞率>99%(图2L、O、Q)，CD45表达阴性，阳性细胞率为3.4%(图2M、P、Q))；共表达CD29+和CD90+、CD45-细胞率为96.5%(图2Q)，由此可以说明经过传代，BMSCs纯度>96%。提示运用传代贴壁法体外无菌分离传代纯化可以获得纯度较高的骨髓基质干细胞。

图2 流式细胞术检测第3代BMSCs表面抗原CD29、vCD45和CD90表达Fig.2 Surface antigen expression of CD29, CD45 and CD90 in BMSCsP3 detected by Flow cytometry

2.3 orexin-1受体抑制剂对Wnt通路主要靶点蛋白Dickkopf-1、Gsk3β、β-catenin的影响

由图3和表1所示，BMSCs经Wnt3a和orexin-1受体抑制剂处理后的Dickkopf-1、β-catenin和GSK3β表达都升高，其中1×10-5mol/Lorexin-1受体抑制剂组Dickkopf-1的表达比1×10-6mol/L orexin-1受体抑制剂组的高；而GSK-3β、β-actin的表达比1×10-6mol/Lorexin-1受体抑制剂组的低，两组β-catenin的表达无明显差别。

图3 免疫印迹曝光后X光片扫描图Fig.3 Scanned image on X-rays after exposure of Western blot

表1 orexin-1受体抑制剂对大鼠骨髓基质干细胞Wnt通路靶点蛋白影响Table 1 Effects of orexin-1 receptor inhibitor on target protein of Wnt signaling pathways in BMSCs

2.4 orexin-1受体抑制剂对Wnt通路相关基因表达的影响

如表2所示，与Control组对比，Wnt3a上调β-catenin mRNA和GSK3βmRNA的表达(P<0.05)；与Control组对比，orexin-1受体抑制剂也上调了β-catenin mRNA和GSK3βmRNA的表达(P<0.05)。

表2 orexin-1受体抑制剂对大鼠骨髓基质干细胞基因的影响Table 2 Effects of orexin-1 receptor inhibitor on the

注：与对照组相比▲P<0.05
Note：▲P<0.05 vs control

3 讨论

Wnt蛋白是一组由半胱氨酸残基组成的分泌型糖脂蛋白，作为调控细胞生长、发育和分化的重要信号途径，一直是医学研究的热点。Wnt信号通路主要由19种分泌蛋白组成，一般认为Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt8、Wnt8b是经典Wnt蛋白，而Wnt4、Wnt5a，Wnt5b、Wn6t、Wnt7a、Wnt11是非经典蛋白[6]，这些蛋白和相应的膜受体发生结合可激发一系列的继发反应，能和一7次跨膜大分子(发卷样蛋白)特异性识别，在低密度脂蛋白受体相关蛋白5和6(LRP5/6)协同下共同作用[7]。在Wnt/β-catenin信号通路中，主要调控成骨分化的靶点有DKKs、sFRPs、GSK3β、WIF、Sclerostin等，最终由于β-catenin表达增多而促进骨形成。当Wnt与frizzled受体以及其共受体，还有低密度脂蛋白相关蛋白LRP 5/6受体结合，继而与Axin、Frat-1形成复合体，抑制糖原合成激酶3(GSK3)的活性，β-catenin的分解被抑制，在胞质内蓄积的β-catenin进而转移入细胞核，然后与核内转录协同因子T细胞因子(TCF)/淋巴增强因子(LEF)相互作用，从而介导Wnt引起的基因转录的改变，影响细胞的分裂、分化和成熟[8]。

骨髓基质干细胞是成骨细胞的前体细胞，广泛存在于骨髓及松质骨中，在骨代谢中起重要作用。同时作为一种多潜能干细胞，主要表现出自我增殖和多向分化潜能，可以向成骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、软骨细胞等方向分化，即具有可塑性。此外，骨髓基质干细胞向成骨细胞方向分化与向脂肪细胞方向分化之间存在着此消彼长的关系。有研究发现，骨质疏松症患者其骨髓中的松质骨骨量与脂肪细胞呈反比，骨量的减少总是相伴骨髓腔内脂肪细胞的增多，而通过靶向调控BMSCs分化方向的相关因素能调控BMSCs的分化方向，从而增加成骨细胞的数目和活性。目前诱导BMSCs成骨分化有机械因素如刚度矩阵[9-10]，还有化学刺激如β-磷酸甘油、地塞米松和抗坏血酸。BMSCs来源广泛，易于分离培养，已被认为是理想的工程种子细胞，越来越受到学者们的青睐，BMSCs替代疗法以及定向调控BMSCs分化方向的方法成为治疗骨质疏松等骨丢失相关疾病的新途径。

Wnt3a是作用于经典Wnt信号通路诱导转录的TCF/LEF靶基因的Wnt蛋白之一，能激活Wnt/β-catenin，从而引起Wnt信号通路基因和蛋白的改变。Wnt3a和GSK3β抑制物会抑制地塞米松作用的hMSC成骨分化。研究发现成骨诱导的早期加入Wnt3a干预可促进MSCs碱性磷酸酶表达，促进成骨分化，晚期则会抑制碱性磷酸酶表达抑制成骨分化[11]，推断当MSCs开始成骨分化时，经典Wnt信号通路促进干细胞向成骨方向分化，但在分化的终末又会抑制成骨细胞的最终分化成熟。本实验中Wnt3a组的β-catenin mRNA和β-catenin蛋白表达都比Control组高，与Filali M结果一致[12]。

Dickkopf-1与GSK3β蛋白表达升高对Wnt/β-catenin信号通路是起抑制作用的，本实验中orexin-1受体抑制剂对Dickkopf-1与GSK3β蛋白表达的抑制作用，其意义有待进一步的研究。我们推测，orexin-1受体抑制剂的作用可能是多靶点的，除了对Dickkopf-1与GSK3β蛋白有作用外，还可能作用于Wnt/β-catenin信号通路其他的靶点，综合的结果使β-catenin的表达升高。此外，由于非经典Wnt信号通路在MSCs成骨分化过程中可促进成骨分化，所以orexin-1受体抑制剂也可能通过激活非经典Wnt信号通路，使β-catenin的表达升高。