小鼠11β-1基因真核表达载体的构建及应用

辛婧，叶磊，杨可，沈亚非，邓飞

[1.河南省漯河市中心医院（漯河市医学高等专科学校第一附属医院）内分泌科，河南 漯河 462000；2.河南省漯河市召陵区人民医院神经内科，河南 漯河 462000]

辛婧1，叶磊2，杨可1，沈亚非1，邓飞1

[1.河南省漯河市中心医院（漯河市医学高等专科学校第一附属医院）内分泌科，河南 漯河 462000；2.河南省漯河市召陵区人民医院神经内科，河南 漯河 462000]

目的构建小鼠11β-羟类固醇脱氢酶基因的慢病毒真核表达载体PLJM1-11β-HSD1-GFP，建立小鼠前体脂肪细胞（3T3-L1）高表达基因的稳定感染细胞株，为基因的功能研究奠定基础。方法利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）从小鼠肝脏cDNA中扩增11β-HSD1开放阅读框ORF，构建针对基因的真核表达载体，转化感受态DH5α菌株，抽提质粒并进行测序鉴定。用测序成功的质粒和慢病毒包装质粒共同转染293T细胞，产生慢病毒并转染3T3-L1细胞。根据绿色荧光效率挑取单克隆细胞团筛选出稳定细胞株，通过Western blot鉴定PLJM1-11β-HSD1-GFP转染成功。结果经酶切、PCR及测序验证，PLJM1-11β-HSD1-GFP真核表达载体构建成功，并包装慢病毒，绿色荧光效率90%以上，并利用其慢病毒悬液成功感染3T3-L1细胞，筛选出的稳定感染细胞株的3T3-L1细胞成功高表达11β-HSD1蛋白。结论成功构建了基因的真核表达载体，并建立高表达的稳定感染细胞株PLJM1-11β-HSD1-GFP-3T3-L1，为进一步研究基因的功能，特别是在肥胖中的研究奠定了基础。

基因；真核表达载体；前体脂肪细胞；肥胖

11β-羟类固醇脱氢酶（11beta-hydroxysteriod dehydrogenase，11β-HSD1）在体内广泛分布，表达于脂肪、肝脏、肌肉、性腺及中枢神经系统等，以脂肪组织和肝脏中的含量最高[1]。它是糖皮质激素的代谢酶，有重要的生物学活性，有还原酶与氧化酶的双重作用，但以还原酶作用为主，需要烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADP+）参与，有活化糖皮质激素的作用，可以使人体无活性的可的松（动物的皮质酮）转化为有活性的氢化可的松（皮质醇）[2]。资料显示，11β-HSD1的转基因小鼠显示内脏脂肪组织肥厚；在代谢综合征患者脂肪库中细胞内11β-HSD1的活性是普遍增加的[3]。这可能与糖皮质激素能增加脂肪细胞内合成代谢有关，而11β-HSD1主要使糖皮质激素活化，提示其可能与向心性肥胖、胰岛素抵抗及糖尿病有关[4]。本研究拟构建基因的真核表达载体，并建立高表达该基因的稳定感染细胞株，以进一步研究该基因与肥胖、胰岛素抵抗及糖脂代谢相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

PolyATtract_Series9600TMmRNA Isolation System试剂盒、末端转移酶（TdT）、逆转录酶（AMV）及Taq DNA聚合酶均购自美国Promega公司，焦碳酸二乙酯（DEPC）及ExpandTMTemplate PCR System购自日本TaKaRa公司，DH5α菌株及PLJM1-NRG1-GFP载体由南京医科大学分子遗传研究室李建民教授馈赠，Lipofectamine 2000细胞转染试剂盒购自美国Invitrogen公司，3T3-L1前体脂肪细胞株、293T细胞购自上海细胞生物研究所，DMEM培养液、10%胎牛血清购自南京生兴公司，3-异丁基-1-甲基磺嘌呤（MIX）、胰岛素及地塞米松购自美国Sigma公司，11β-HSD1兔源抗体购自美国Research Genetics公司，二抗羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶及β-actin抗体购自武汉生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计根据GenBank登录号NM_008288 mRNA序列设计引物，由上海华大基因科技有限公司合成。正向引物：GGGGCTAGCGGATCCGCCACC ATGGCAGTTATGAAAAATTACC；反向引物：GGGG AATTCCTCGAGCCTAGTTACTTACAAACATGTCC。正向引物酶切位点为，反向引物酶切位点为扩增目的片段大小881 bp。

1.2.2 小鼠肝脏总RNA的抽提用PolyAT-tract_Series9600TMmRNA Isolation System试剂盒提取BABL/C 8周的小鼠肝脏组织总RNA，提取2μl经琼脂糖凝胶电泳观察总RNA完整性，并用紫外分光光度计分别测定260 nm、280 nm波长下的光密度（OD）值，并检测总RNA的纯度，其余RNA于-70℃冰箱冷冻保存。

1.2.3 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增目的基因取2μg mRNA加入PrimeSriptTMRT reagent Kit逆转录反应体系中，42℃孵育90 min，逆转录合成cDNA，结束后加入RNAase H内切酶，37℃孵育30 min，降解RNA。以上述小鼠的cDNA为模板扩增目的片段。PCR的反应条件为：94℃预变性5 min，94℃30 s，54℃30 s，72℃延伸1 min，35个循环，72℃10 min，4℃2 min，获取小鼠基因全长开放阅读框ORF。

1.2.4 真核表达质粒PLJM-11β-HSD1-GFP制备以上述小鼠3T3-L1细胞的cDNA为模板，相应引物扩增11β-HSD1全长ORF，用TaKaRa DNA Fragment Purification Kit纯化靶DNA片段。将纯化后的PCR产物行双酶切。对酶切后产物用1%琼脂糖凝胶行电泳检测。并在切胶仪上切下目的片段。用Ultra-Sep Gel Extraction Kit（OMEGA）纯化切胶产物。将酶切纯化后的目的片段11β-HSD1连接至PLJM1-NRG1（NheI/EcoRI）载体（10μl体系：目的片段2μl，载体1μl，2×Ligase buffer 5μl，T4连接酶1μl，ddH2O 1μl；条件22℃1 h）。用连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，在氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）抗性的LB固体平板上生长过夜（37°孵箱16～18 h）。在过夜后的固体平板上挑取5个单克隆，分别加至Amp抗性的5 ml LB培养基里摇菌过夜并做好标记，次日以菌液为模板，以11β-HSD1-F/R为引物作PCR并行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。对获取的阳性克隆进行保种，同时经碱裂解法提取质粒DNA，以CMV-F和11β-HSD1-R为测序引物并送上海华大基因科技有限公司进行测序。

1.2.5 序列分析应用NCBI网站BLAST分析软件，对上述测序结果进行序列比对，鉴定PLJM1-11β-HSD1-GFP载体多克隆位点区表达序列的可靠性和准确性。

1.2.6 PLJM1-11β-HSD1-GFP-3T3-L1慢病毒细胞株的构建用中抽试剂盒抽取质粒PLJM1-11β-HSD1-GFP及空载对照质粒PLJM.1，保证OD值1.8～1.9，浓度在1 000μg/ml以上。转染前24 h将处于对数生长期的293T细胞铺6 cm培养皿，2×106～4×106个/皿。转染体系如下：质粒PLJM1-11β-HSD1-GFP（或空载对照质粒PLJM.1）4μg，包装质粒PVSVG 2μg，delta 8.91 3μg，与Lipofectamine 2000 20μl混合共同孵育形成复合物，然后转染293T细胞。转染后24 h换液3 ml，并用荧光显微镜观察拍照。转染后48和72 h收集包装产生的病毒上清，经0.45μm滤膜过滤后加入polybrene（Millipore），使终浓度为10μg/ml。感染前24 h将3T3-L1细胞接种至6 cm培养皿，使感染前细胞密度为10%～20%。24 h后弃去培养液，用上述病毒上清3 ml感染靶细胞，37℃培养6 h后换液加入3 ml完全培养液DMEM。感染48 h后观察荧光表达情况。根据荧光效率挑单克隆筛选稳定转染株，并进行冷冻保存。

1.2.7 Western blot检测分别提取正常3T3-L1细胞、高表达11β-HSD1的3T3-L1及转入空载质粒的3T3-L1细胞的总蛋白质，用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，制备14.7%分离胶和5%浓缩胶，60 V稳压电泳；半干转膜，封闭，按Western blot检测试剂盒说明书进行操作。一抗为11β-HSD1多克隆抗体（抗体浓度为1∶200），二抗为羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶，（抗体浓度为1∶800），用免疫印迹增强化学发光法分别检测3组细胞株的11β-HSD1蛋白表达水平。实验所得的Western blot条带经Photoshop软件处理，在Bandscan分析软件中测得各自总度值，采用自身β-actin灰度值校正并进行定量分析。实验数据输入Excel数据库用Excel软件进行作图。

1.3 统计学方法

采用SPSS 14.0统计学软件对本研究中的数据进行分析和处理，计量资料应用均数±标准差（±s）表示，采用配对检验，<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠11β-HSD1 ORF片段扩增及载体克隆

以小鼠肝脏cDNA为模板，用正向引物和反向引物进行PCR扩增，得到小鼠11β-HSD1 ORF片段，目的片段为881 bp（见图1）。

2.2 PLJM1-11β-HSD1-GFP重组载体的鉴定

以正向引物与反向引物进行PCR扩增，用Promega PCR纯化试剂盒进行纯化，酶切产物（见图2）行切胶纯化，将纯化后产物连接至PLJM1-NRG1-GFP载体。随机选取5个阳性克隆，行PCR鉴定（见图3），获取的阳性克隆经碱裂解法提取质粒DNA测序（见图4），测序结果经序列比对分析确认无任何突变、插入等异常，慢病毒载体PLJM1-11β-HSD1-GFP构建成功（见图5）。

2.3 慢病毒载体转染293T细胞

图1 小鼠11β-1基因ORF扩增片段

图2 小鼠11β-1基因PCR酶切产物

图3 小鼠11β-基因ORF片段单克隆PCR结果

慢病毒载体PLJM1-11β-HSD1-GFP转染293T细胞24 h后荧光显微镜拍照见图6，绿色荧光效率90%以上。

2.4 收取病毒上清感染3T3-L1细胞

收取293T细胞病毒上清感染3T3-L1细胞，48 h后荧光显微镜拍照结果见图7。

2.53 T3-L1单克隆细胞株绿色荧光蛋白的表达

根据荧光情况挑单克隆并筛选稳定感染细胞株，3T3-L1单克隆细胞株绿色荧光蛋白的表达见图8。

图4 PLJM1-11β-HSD1-GFP质粒测序图

图5 PLJM1-11β-HSD1-GFP质粒序列比对图

图6 重组质粒转染293T细胞后绿色荧光蛋白的表达（荧光显微镜×100）

图7 重组质粒转染3T3-L1细胞后绿色荧光蛋白的表达（荧光显微镜×100）

2.6PLJM1-11β-HSD1-GFP质粒转染3T3-L1细胞蛋白水平验证

分别提取3T3-L1、PLJM1-3T3-L1及PLJM1-11β HSD1-GFP-3T3-L1细胞组蛋白进行Western blot检测，结果提示PLJM1-11βHSD1-GFP质粒转染成功，PLJM1-11β-HSD1-GFP-3T3-L1组11β-HSD1蛋白表达水平明显升高，见图9。

图83 T3-L1单克隆细胞株绿色荧光蛋白的表达（荧光显微镜×100）

图9 各组细胞11β-HSD1蛋白表达情况

3 讨论

11β-HSD1作为一种微线粒体酶，主要负责有活性与无活性的糖皮质激素之间的互相转化，通过控制底物即糖皮质激素的利用率，从而调控组织特异性糖皮质激素受体的活性[5-6]。11β-HSD有2种同工酶。其中11β-HSD2是辅酶Ⅰ（NAD）依赖性脱氢酶，主要使活性的可的松变为无活性的氢化可的松。主要作用于盐皮质激素敏感的靶组织如肾脏，结肠，唾液腺，胎盘等[7]。11β-HSD1直到最近才被发现并认为是重要的生物酶，是还原型辅酶Ⅱ（NADPH）依赖性的还原酶，与11β-HSD2作用相反，主要负责将无活性的氢化可的松转化为有活性的可的松[8]。它广泛分布于各组织，主要分布于肝脏、脂肪、性腺、脑、脉管系统等，这些组织则以糖皮质激素受体占优势。研究表明，11β-HSD1调节糖皮质激素受体与配体的结合，参与了库欣综合征相似的疾病的发生发展，如向心性肥胖、糖尿病、多囊卵巢综合征以及痴呆[9-10]。

慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）为基础发展起来的基因治疗载体[11]。携带有目的基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒及细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或组织，实现目的基因在宿主细胞中得到长期而稳定的表达[12]。经过改建后的慢病毒载体能够容纳约10 kb左右的外源基因，因此大多数的cDNA都能够被克隆入慢病毒载体。293T细胞由293细胞派生，属人肾上皮细胞系，作为包装细胞，在包装后产生了高滴度的病毒颗粒，同时表达目的基因。

本文利用慢病毒载体技术成功构建了带有GFP目的基因HSD1的慢病毒载体PLJM1-HSD1-GFP，同时建立了3T3-L1稳定感染细胞株PLJM1-HSD1-GFP-3T3-L1，为进一步研究HSD1的生物学功能奠定了必要的基础。

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（张蕾编辑）

Construction and role of mouse PLJM1-11β-HSD1-GFP plasmid

Jing Xin1,Lei Ye2,Ke Yang1,Ya-fei Shen1,Fei Deng1
(1.Department of Endocrinology,Luohe Central Hospital,Luohe,Henan 462000,China;2.Department of Neurology,the People's Hospital of Shaoling District,Luohe,Henan 462000,China)

ObjectiveTo construct a lentiviral vector of PLJM1-11β-HSD1-GFP and establish a stable cell line of 3T3-L1 with high expression of mousegene,and lay the foundation for the research ofgene.MethodsOpen reading frame(ORF)fragment of mouse tissues by RT-PCR,then inserted into the PLJM1-NRG1-GFP vector and transformed into competent DH5α strain ofThe plasmid was extracted and used for sequencing.The successfully-sequenced plasmid PLJM1-11β-HSD1-GFP and the packaging plasmid were transfected to 293T cell line to produce recombinant lentivirus.3T3-L1 cell line was transfected by recombinant virus and the stable cell line was isolated by selecting the single clone with GFP,and high expression of 11β-HSD1 was identified by Western blot.ResultsThe eukaryotic expression vector of PLJM1-11β-HSD1-GFP was constructed and confirmed by DNA sequencing.The lentivirus vector ofnamed PLJM1-11β-HSD1-GFP was successfully constructed and the virus was packaged in 293T cells.3T3-L1 cells were transfected by recombinant virus and the stable cell line was selected by green fluorescence efficiency,which showed that the lentivirus vector transfection rate was over 90%.A dramatically elevated protein level of 11β-HSDl was expressed in the positive clones of 3T3-L1 cells compared with the control group.Conclusions Mouse PLJM1-11β-HSD1-GFP plasmid has been successfully constructed.The 3T3-L1 cellsgene was amplified from mouse livertransfected by PLJM1-11β-HSD1-GFP could effectively elevate the expression ofgene,and can be used in the functional researches of mousegene,especially those related to obesity.

gene;eukaryotic expression vector;3T3-L1 cell;obesity

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.16.003

1005-8982（2017）16-0012-06

Q782

A

2016-11-28