胃癌中高表达的CBX7对细胞迁移、侵袭的影响

宗华，秦杰，李红春，朱立元

（广东省深圳市第三人民医院普外科，广东 深圳 518000）

胃癌中高表达的CBX7对细胞迁移、侵袭的影响

宗华，秦杰，李红春，朱立元

（广东省深圳市第三人民医院普外科，广东 深圳 518000）

目的探究人胃癌组织中染色盒同源物7（CBX7）的表达及对胃癌细胞侵袭能力的影响。方法收集2013年1月1日-2015年1月1日间于该院普通外科行手术切除的45例胃癌及对应癌旁组织，免疫组织化学染色观察CBX7蛋白表达，分析胃癌组织中CBX7蛋白表达高低与肿瘤临床特征的关系。通过重组质粒在胃癌SGC-7901细胞中过表达CBX7，经Transwell小室实验确定CBX7过表达对胃癌细胞迁移侵袭的作用。结果CBX7在胃癌组织中表达较癌旁组织下降（=3.517，=0.000），胃癌组织低表达CBX7与肿瘤淋巴结转移（χ2=5.829，=0.022）及高TNM分期（Ⅲ+Ⅳ期，χ2=4.465，=0.047）相关。过表达CBX7对SGC-7901的迁移（=42.040，=0.000）及侵袭（=40.119，=0.000）具有显著的削弱作用。结论CBX7在胃癌组织中表达降低，过表达CBX7能够通过抑制胃癌细胞迁移及侵袭发挥抗肿瘤作用。

CBX7；胃癌；迁移；侵袭

胃癌是我国常见的消化系统恶性疾病，幽门螺杆菌感染是胃癌发生的主要危险因素之一[1]。由于胃癌早期仅有腹痛、纳差等非特异性表现，许多患者就诊时已失去根治性手术机会。目前，生物靶向诊断及治疗被认为是改善胃癌患者预后的重要方法之一。

染色盒同源物7（chromobox homolog 7，CBX7）是黑腹果蝇的异染色质蛋白在人类细胞中的同源物，定位于人染色体22q13.1上，共有6个外显子，其编码的蛋白质主要分布于细胞核的染色质当中，通过与染色质的结合而发挥其调节功能[2]。但CBX7在胃癌中的表达及其生物学功能尚不完全清楚。

本研究在胃癌组织中检测了CBX7的表达，并探究CBX7表达与肿瘤临床特征间的相关性。利用基因重组技术过表达胃癌SGC-7901细胞中的CBX7，检测过表达CBX7后细胞迁移与侵袭的变化。旨在为CBX7成为胃癌诊断生物学标志物及治疗靶点提供一定的研究依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料和试剂

本研究共收集在2013年1月1日-2015年1月1日行手术切除的胃癌及对应癌旁组织45例。其中男性31例，女性14例；年龄在47～65岁之间，中位年龄53岁。所有入组患者均签署研究知情同意书。切取组织标本于4%多聚甲醛溶液中保存。Trizol试剂及转染试剂均购自美国英威捷公司。逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）试剂盒购自北京天根生物科技有限公司。CBX7正向引物（5'-CCTGCTTCCTGGTCAC TTTC-3'；反向引物5'-CAG GGAGCTGGCTCACTA CA-3'）及β-actin正向引物（5'-CTCCATCCTGGCC TCGCTGT-3'；反向引物5'-GCTGTCACCTTCACCGT TCC-3'）引物由北京天根生物科技有限公司合成。SP免疫组织化学检测试剂盒由北京中杉金桥公司提供。基于pEX-1（pGCMV/MCS/EGFP/Neo）真核表达载体（货号：C05001）的CBX7过表达质粒由上海吉玛生物科技有限公司合成提供，以空载体质粒为对照质粒。CBX7及β-actin抗体均购自美国Santa Cruz公司，人胃癌SGC-7901细胞由广东省深圳市第三人民医院实验室保存，Transwell小室购自美国康宁公司，基质胶购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色石蜡包埋的组织切片首先脱蜡、水化，进而行高压抗原修复。通过3%双氧水H2O2灭活内源性氧化物酶，10%血清封闭；以1×PBS溶液配制1∶100兔抗人CBX7抗体工作液充分覆盖组织切片；4℃孵育一抗过夜，次日洗去多余一抗，并滴加相应物种二抗工作液；洗净多余二抗后用HRP-BIO复合物，反应后使用DAB进行显色。每张切片在×400放大下随机选取10个视野观察阳性表达细胞数量，按0分，<5%；1分，6%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～75%及4分，>75%的方法计分[3]。以每张切片的平均得分为最终得分。

1.2.2 qRT-PCR检测按试剂说明书采用氯仿-苯酚抽提法提取SGC-7901细胞总RNA。定量500 ng细胞总RNA，按逆转录说明书配置逆转录体系，采用42℃孵育15 min后95℃孵育30 min之步骤合成cDNA。取2μl cDNA为模板，按说明书配制qPCR反应体系，使用Bio-Rad Real-time PCR扩增仪进行PCR扩增CBX7及β-actin。

1.2.3 质粒转染SGC-7901细胞在含10%FBS的1×DMEM培养基中培养至稳定传代2、3代。按过夜增殖至愈合度达70%之密度接种6孔细胞培养板。达到预定培养密度后移除培养基，1×PBS溶液充分洗涤细胞。转染分组：CBX7组加入2 500 ng/孔CBX7质粒及5μl转染试剂；对照组加入2 500 ng/孔阴性对照质粒及5μl转染试剂。添加DMEM培养液至终体积2 ml/孔。6 h后更换正常培养基继续培养。

1.2.4 Western blot检测提取转染72 h后的SGC-7901细胞总蛋白。垂直电泳分离蛋白后以70V恒压转膜120 min，5%脱脂牛奶室温封闭1 h；以1∶1 000稀释的CBX7抗体及β-actin抗体4℃下孵育相应条带过夜。洗去残余一抗后采用1∶5 000稀释的HRP标记山羊抗兔或抗鼠二抗室温孵育条带1 h。于暗室内，ECL法发光观察蛋白表达。

1.2.5 Transwell小室检测按1∶8比例采用DMEM培养液稀释基质胶后，100μl/孔包被Transwell小室膜的上室面制成包胶小室来检测细胞侵袭；采用未包胶小室来检测细胞迁移。取转染72 h后的SGC-7901细胞，使用无血清培养基重悬细胞至5×105个/ml，上层小室每室加入250μl细胞悬液，培养室中加入含10%胎牛血清的培养基，置于37℃、5%二氧化碳CO2孵箱中培养12 h。用棉签擦净上室面细胞，4%多聚甲醛固定下室面细胞，Giemsa染液染色。100倍光镜下随机选择10个视野计数下室面的细胞个数。以每个小室的平均细胞数为最终计数。

1.3 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，配对检验分析CBX7在患者标本中的表达，成组检验分析其余计量资料。χ2检验分析计数资料。<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌中CBX7的表达

通过免疫组织化学染色发现CBX7蛋白主要定位于胃癌细胞及正常胃腺细胞的细胞核中（见图1），以胃癌组织中CBX7免疫组织化学染色评分的均值为界，45例胃癌组织可划分为CBX7低表达组（=33）及高表达组（=12）。对两类组织中CBX7免疫组织化学评分进行统计学分析表明胃癌组织中CBX7蛋白的表达低于癌旁组织（1.24±0.31）vs（3.52±0.47），差异有统计学意义（=3.517，=0.000）。

2.2 CBX7在胃癌的临床意义

针对不同CBX7表达量的两组患者进行统计分析表明，淋巴结转移（χ2=5.829，=0.022）及高TNM分期（III+IV期，χ2=4.465，=0.047）等显示肿瘤恶性程度较高的病理特征较多出现在CBX7低表达的胃癌组织中。见附表。

2.3 过表达CBX7抑制SGC-7901细胞迁移及侵袭

图1 CBX7在胃癌及癌旁组织中的表达（×400）

图2 过表达CBX7对SGC-7901迁移及侵袭的影响

向SGC-7901细胞内转染入重组CBX7过表达质粒后，过表达CBX7后胃癌细胞内CBX7 mRNA（=37.028，=0.000，见图2A）和蛋白（=39.156，=0.000，见图2B）的表达都明显提高。过表达CBX7后采用Transwell小室检测发现CBX7组迁移细胞数量（74.201±5.592 vs 35.374±5.217），差异有统计学意义（=42.040，=0.000），侵袭细胞数量（38.188±7.171 vs 16.224±3.113），差异有统计学意义（=40.119，=0.000），说明CBX7对细胞迁移及侵袭能力具有负向调控作用（见图2C）。

附表CBX7表达与GC患者临床病理特征的关系例

3 讨论

CBX7属于多梳蛋白家族，其在哺乳动物大脑、心脏、肾脏及骨骼肌中均有表达以维持正常组织的生长发育[4]。近年来的研究发现CBX7在肿瘤中具有多种生物学功能，可以通过下调INK4α/ARF信号通路而抑制肿瘤细胞增殖[5]，作为MIR-9[6]及MIR-375[7]等多种microRNA的靶基因而对细胞侵袭发挥调控作用，还能够促进肿瘤干细胞增殖和自我更新[8]。本研究发现，CBX7低表达于胃癌组织中。淋巴结转移及高TNM分期也较多的出现在CBX7低表达患者中，提示CBX7可能通过下调胃癌细胞侵袭而促进肿瘤发展。陈敏等[9]在甲状腺乳头样癌中的研究也表明CBX7在肿瘤中的表达下调，说明CBX7的异常表达可能对肿瘤早期诊断具有一定的指导意义。

本研究通过基因重组技术提高了胃癌SGC-7901细胞中CBX7的表达，同时SGC-7901细胞的迁移及侵袭在过表达CBX7后也明显下调。上皮细胞间质化改变是影响细胞迁移及侵袭能力的重要机制之一[10]，KARAMITOPOULOU等[11]在胰腺癌中的研究发现，在组织学分化越差的胰腺癌组织中CBX7表达量越低，在胰腺癌细胞中过表达CBX7也可以提高E-cadherin的表达。预后分析还提示，低CBX7表达的胰腺癌患者生存期明显缩短。

综上所述，CBX7的低表达在人类恶性肿瘤中具有一定的普遍性，且CBX7能够抑制多种肿瘤细胞的侵袭能力，是一种潜在的生物治疗靶点。

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（张蕾编辑）

CBX7 expression in human gastric cancer and its role in cell migration and invasion

Hua Zong,Jie Qin,Hong-chun Li,Li-yuan Zhu
(Department of General Surgery,the Third People's Hospital of Shenzhen,Shenzhen,Guangdong 518000,China)

ObjectiveTo study the expression of chromobox homolog 7(CBX7)in human gastric carcinoma and its role in cell migration and invasion.MethodsImmunohistochemical method was applied to detect the expression of CBX7 in gastric cancer and matched tumor-adjacent tissues of 45 patients.The correlations between CBX7 expression and clinical features were analyzed by Pearson chi-square test.Recombinant CBX7 plasmid was used to over-express CBX7 in SGC-7901 cells.The effect of CBX7 on cell migration and invasion was measured by Transwell assay.ResultsThe expression of CBX7 was significantly down-regulated in the gastric cancer tissues,and the low expression of CBX7 was associated with lymphatic metastasis and advanced TNM stage(stageⅢandⅣ)(<0.05).Over-expression of CBX7 inhibited the migration and invasion of SGC-7901 cells(<0.05).ConclusionsCBX7 expression is decreased in gastric cancer tissues.Up-regulation of CBX7 expression could play an anti-cancer role through inhibition of cell migration and invasion.

CBX7;gastric cancer;migration;invasion

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.16.008

1005-8982（2017）16-0040-04

R735.2；

A

2016-11-21