高效液相色谱—串联质谱同时测定粪箕笃中小檗碱和千金藤素含量

白丽丽++++++戴华++++++程莎++++++孔杜林

[摘要] 目的 建立高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）同时测定海南粪箕笃中小檗碱和千金藤素含量的方法。 方法 色谱柱Phenomenex Synergi Fusion-RP 80A（2.0 mm×50 mm，4 μm）；流动相为水（0.1‰甲酸，A相）-甲醇（0.1‰甲酸，B相）；柱温40℃，流速为0.35 mL/min，梯度洗脱。采用电喷雾正离子模式电离，选择多重反应监测模式进行检测。 结果 小檗碱和千金藤素在5.0～1000.0 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数> 0.98；小檗碱的平均回收率为101.46%～104.76%，相对标准偏差（RSD）为2.14%；千金藤素的平均回收率为95.96%～104.39%，RSD为4.63%；测得文昌、兴隆两地粪箕笃中小檗碱和千金藤素分别为0.889、1.07 μg/g和7.62、38.0 μg/g。 结论 HPLC-MS/MS具有简单、分析速率快、灵敏度高等优点，适用于粪箕笃及千金藤属植物中生物碱的定量分析。

[关键词] 粪箕笃；高效液相色谱-串联质谱法；生物碱；含量测定

[中图分类号] R917 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）07（c）-0145-03

[Abstract] Objective To establish a method for the simultaneous determination of berberin and cepharanthine in Stephania longa L. by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）. Methods The separation of the analytes were carried out on a Phenomenex Synergi Fusion-RP 80A column （2.0 mm×50 mm， 4 μm） using methanol containing 0.1‰ formic acid as mobile phase， the column temperature was 40℃， flow rate was 0.35 mL/min， gradient elution. HPLC-MS/MS was performed in multiple reaction monitoring mode via positive electrospray ionization （ESI+）. Results The calibration curves showed good linearity over the tested range from 5.0 to 1000.0 ng/mL for 2 compounds （the correlation coefficients> 0.98）.The recoveries and the relative standard deviations of berberin and cepharanthine was 101.46%-104.76%， 2.14% and 95.96%-104.39%， 4.63% respectively. The content of berberin and cepharanthine in Stephania longa L. from Wenchang， Xinglong 2 areas were 0.889， 1.07 μg/g and 7.62， 38.0 μg/g. Conclusion The method is simple， fast and highly sensitivity， which can be used to control the quality of alkaloids from Stephania longa L..

[Key words] Stephania longa L.； HPLC-MS/MS； Alkaloids； Content determination

糞箕笃（Stephania longa L.）为防己科千金藤属植物，多年生草质藤本。在我国福建、广东、海南等地区有广泛分布，是天然的南药资源[1]。具有清热解毒、消肿利湿、袪风活络、抑菌、镇静和镇痛等功效[2-7]。该属药用植物繁多，富含生物碱，主要有可扑碱型、阿扑碱类，原小檗碱类，莲花烷类生物碱、双苄基异喹啉类、吗啡二烯酮型等。有关粪箕笃中生物碱的分离、结构鉴定及化学合成均有报道[8-12]，生物碱含量测定的方法很多[13-18]，但采用高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）对粪箕笃生物碱进行定性定量分析尚未有报道。为寻找千金藤属植物中有用的生物碱资源，本文通过对海南文昌、兴隆粪箕笃根茎中的两种生物碱进行含量测定，建立HPLC-MS/MS定性定量分析方法，为粪箕笃及其千金藤属植物的开发利用提供一定的理论指导。

1 仪器与试药

1.1 仪器

仪器：API4000+串联四级杆质谱仪（AB Sciex公司，美国），通过Turbo V离子源接口与岛津公司Prominence UFLC液相色谱仪串联。AB-SCIEX软件控制数据采集和处理；液质联用仪LC-MS专用氮气发生器（NitroFlowLab，美国）；离心机（Sigma，德国）；分析天平（北京赛多利斯公司）；超纯水器（Millipore公司）；紫外分光光度计（北京瑞利分析仪器有限公司）。

1.2 试药

小檗碱（批号110713-201613）和千金藤素（批号111647-200301）对照品（中国食品药品检定研究所）；甲醇（HPLC级，国药集团化学试剂有限公司），乙腈为优级纯（Tedia，美国）；其他药品均为分析纯，水为超纯水。

粪箕笃采自海南文昌、兴隆，由海南医学院曾念开教授鉴定为防己科（Menispermaceae）千金藤属（Stephania）粪箕笃，阴干，粉碎成细粉备用。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称取适量小檗碱和千金藤素于容量瓶中，加甲醇溶解并稀释定容至刻度配制成1 μg/mL标准储备液，于4℃冰箱中储存。

2.2 供试品溶液及样品的制备

精密称定恒温干燥的粪箕笃粉末2 g（精确至0.0001 g），置于圆底烧瓶中，用85%乙醇回流2 h，过滤，于200 mL容量瓶中定容至刻度，于4℃冰箱中储存、备用。

将供试品溶液转移至离心管中，5000 r/min离心5 min，吸取5.0 mL上清液经0.22 μm滤膜过滤，制成样品等待分析。

2.3 液相色谱-质谱联用条件

色谱条件：色谱柱为Phenomenex Synergi Fusion-RP 80A（2.00 mm×50 mm，4 μm）；流动相为水（0.1‰甲酸，A相）-甲醇（0.1‰甲酸，B相）；柱温40℃，流速为0.35 mL/min，进样体积5.0 μL梯度洗脱：0～1 min为0% B，1～1.01 min B相从0%迅速增加到30%，1.01～10 min B相從30%缓缓增加到100%，10～10.01 min从100%回到0%，10.01～15 min维持在0% B进行平衡。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI）正离子模式（+），喷雾电压5.5 kV，喷雾温度550℃，帘气为25psi，GAS1为40psi、GAS2为60psi，CAD为6；多反应检测扫描（MRM）模式对小檗碱、千金藤素进行扫描，每个离子对的扫描时间为10 ms。小檗碱和千金藤素检测离子对分别为337.10→321.10和607.3→365.1。两种生物碱的质谱检测参数见表1。

2.4 线性关系考察

准确移取小檗碱（1.0 μg/mL）、千金藤素（1.0 μg/mL）的对照品溶液并依次配成5.0、10.0、50.0、100.0、500.0、1000.0 ng/mL对照品溶液，分别注入液-质色谱仪，记录峰面积。分别以质量浓度（ng/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，小檗碱回归方程为：Y=6.91×103X+1.27×104（r=0.9993），千金藤素回归方程为：Y=5.96×102X+3.6×103（r=0.9898）。结果表明小檗碱和千金藤素均在5.0～1000.0 ng/mL范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.5 方法学考察

2.5.1 重复性试验 准确称取兴隆采摘的粪箕笃粉末2.0 g，按“2.2”项下方法提取，制成样品溶液。按“2.3”项下的色谱条件，进样5 μL，测定，连续进样6次，测得峰面积。小檗碱的RSD为1.90%，千金藤的RSD为2.61%。表明重复性良好。

2.5.2 稳定性试验 把制好的样品溶液及100.0 ng/mL的对照品溶液置于4℃冰箱中储存，分别于0、4、8、12、16、24 h后，按“2.3”项下色谱条件，进样5 μL，测定。对照品小檗碱、千金藤素的RSD分别为2.25%、2.32%，样品溶液小檗碱、千金藤素的RSD分别为2.12%、1.89%。结果表明，与0 h相比较，24 h后峰面积基本保持不变。结果表明对照品及供试品溶液稳定性良好。

2.5.3 精密度和回收率 采用空白样品加标的方法进行添加回收率和精密度试验，在空白样品中添加低、中、高3个水平的标样后（10.0、100.0、500.0 ng/mL），每个添加量平行测定6次，计算回收率及标准偏差。结果表明小檗碱的平均回收率为101.46%～104.76%，RSD为2.14%；千金藤素的平均回收率95.96%～104.39%，RSD为4.63%，结果表明该方法回收率稳定，可满足实际样品的检测要求。小檗碱和千金藤素对照品质谱图如图1所示：其中纵坐标表示响应强度（cps），横坐标表示保留时间（min）。从图1可知，小檗碱对照品和千金藤素对照品分别在3.22、3.01 min处出峰。

2.6 实际样品的测定

文昌和兴隆两地采摘的粪箕笃根茎经阴干、粉碎成40目细粉。分别精确称取2.0 g粉末经回流、过滤后按“2.2”项下方法处理成样品，定容至100 mL，经紫外分光光度法测得其总生物碱含量平均为0.40%[10]。样品经质谱分析如图1所示：文昌和兴隆粪箕笃中小檗碱、千金藤素分别在3.21、3.19；2.98、2.99 min处出峰，峰形尖锐。测得文昌、兴隆两地小檗碱含量分别为0.889、1.07 μg/g，千金藤素含量分别为7.62、38.0 μg/g，分别占总碱含量的0.022%、0.027%和0.19%、0.95%。

3 讨论

由于提取方式的不同，所得总生物碱也有所不同；同一药材不同产地的各种生物碱的种类及含量亦有一定的差异[19-20]。实验结果表明，海南两地粪箕笃中小檗碱和千金藤素含量有明显差异，千金藤素含量远高于小檗碱，但小檗碱地区间含量差异不是十分明显。本方法采用梯度洗脱，分别考察了水-甲醇、水-乙腈、水-甲醇（1‰甲酸）及水-乙腈（1‰甲酸）作为流动相，发现在不含酸的体系中小檗碱、千金藤素有拖尾现象；而水-乙腈（1‰甲酸）作为流动相，基线不是很稳定，分离效果不如水-甲醇（1‰甲酸）效果好。因此，本研究采用水-甲醇（1‰甲酸）为流动相。使用的UFLC液相色谱仪配Phenomenex Synergi Fusion-RP 80A型色谱柱，与文献[15-16]报道HPLC比较，具有用时少、出峰快速、灵敏度好等优点。本研究仅对海南当地药材进行上述相关考察，其他不同地区及植物不同部位的质量考察还有待进一步研究。

总之，本试验建立的HPLC-MS/MS方法具有分析速率快、灵敏度高、专属性强等优点，可用于粪箕笃及千金藤属植物中生物碱的定量分析。

[参考文献]

[1] 中國科学院中国植物志编写委员会.中国植物志，第三十卷[M].北京：科学出版社，1996：40.

[2] 宁蕾，邓业成，骆海玉，等.粪箕笃提取液抑菌活性初步研究[J].江苏农业科学，2011（1）：166-168.

[3] 林启云，谢金鲜.粪箕笃利尿、镇静及镇痛作用研究[J].广西中医药，2001，24（3）：43-45.

[4] 岳贇，庄锡伟，曾旺焕，等.粪箕笃治疗前列腺增生有效部位的筛选[J].江西医药，2016，51（7）：633-634.

[5] 李成彦.愈肾汤治疗慢性肾小球肾炎32例[J].中国中医药信息杂志，2005，12（12）：64-65.

[6] 阮碧波，符吴萸，芮雯等.千金藤碱抗炎免疫与抗肿瘤药理学研究进展[J].亚太传统医药，2016，12（10）：44-47.

[7] 苏毓梅.粪箕笃液治疗慢性化脓性中耳炎[J].人民军医，1979（9）：77.

[8] 唐丽佳，张援虎，郝小燕，等.桐叶千金藤中莲花烷类生物碱的研究[J].中国中药杂志，2010，35（15）：1973-1977.

[9] 劳爱娜，高耀良，唐宗俭，等.粪箕笃生物碱化学成分的研究[J].化学学报，1982，40（11）：1038-1043.

[10] 程彬，戴华，白丽丽.海南粪箕笃根茎中总生物碱含量的测定[J].安徽农业科学，2015，43（16）：67-68.

[11] 黄建明，郭济贤，段更利.RP-HPLC法测定千金藤属植物中7种生物活性生物碱[J].药学学报，1998，33（7）：528-533.

[12] 杨安平，柯俊东.响应曲面法优选粪箕笃总皂苷的提取工艺[J].天津药学，2015，27（2）：5-9.

[13] 刘燕，刘艳，马宇颖，等.鸡骨草叶总生物碱的含量测定及其体外抗氧化活性研究[J].中国医药导报，2016，13（28）：25-27，55.

[14] 王楠楠，唐玉海，韩小年，等.生物碱类物质含量测定方法研究进展[J].西北药学杂志，2006，21（6）：287-289.

[15] 汪亚勤，殷嘉珺，谢道涛，等.MSPD-HPLC法测定金线吊乌龟中千金藤素[J].中成药，2014，36（12）：2557-2560.

[16] 蒋范任，蔡洪鲲，夏用恢，等.高效液相色谱法同时测定芩连片中巴马汀、小檗碱、黄芩苷、连翘苷的含量[J].中南药学，2015，13（12）：1296-1299.

[17] 沈小月，宋敏，杭太俊.LC-MS法鉴定桑叶中生物碱类成分[J].药物分析杂志，2016，36（10）：1737-1744.

[18] 韩成花，白玉华，于春月，等.高效液相色谱法同时测定大庆马齿苋中山奈酚和槲皮素的含量[J].中国医药导报，2014，11（7）：91-93.

[19] 何晓曦，孔令提，张泽生，等.不同产地和不同采收期荷叶中生物碱的含量变化[J].天然产物研究与开发，2013（5）：652-655，661.

[20] 廖静妮，覃山丁，屈啸声，等.广西不同产地对叶百部4种生物碱含量测定及止咳活性比较[J].中药材，2014， 37（11）：1956-1960.