一株大肠杆菌的分离与鉴定

梅京京，韩海锋，王龙飞，张丹，吴庭才，李小康

（1.漯河市畜牧直属分局，河南漯河462000，2.漯河市动物卫生监督所，3.河南科技大学）

一株大肠杆菌的分离与鉴定

梅京京1，韩海锋2，王龙飞1，张丹1，吴庭才3*，李小康3

（1.漯河市畜牧直属分局，河南漯河462000，2.漯河市动物卫生监督所，3.河南科技大学）

选取洛阳自然保护区野生成年白鹭，通过无菌采取其口腔拭子和肛门拭子进行细菌的增殖，得到3株分离菌，再对其进行分离培养、染色镜检、生化鉴定及药敏试验。分离菌在麦康凯培养基上形成边缘整齐表面光滑湿润的红色菌落，革兰氏染色呈阴性。分离菌使甘露醇、鼠李糖、甘油、麦芽糖、甘露糖、乳糖、蔗糖、半乳糖、葡萄糖及棉籽糖发酵变为黄色；该菌具有明胶酶，使明胶水解生成多肽再水解为氨基酸，使明胶液化。吲哚试验呈阳性反应；V-P试验为阴性；MR试验为阳性。药物敏感性试验结果为对青霉素、庆大霉素、环丙沙星、氧氟沙星、链霉素5种药物均为高度敏感。

野生禽类；大肠杆菌；分离；生化鉴定；药敏试验

大肠杆菌病是由大肠杆菌埃希氏菌的某些致病菌引起的疾病总称，常引起禽类局部或全身性感染如心肌炎、肝周炎、气囊炎、败血症、脐带炎、眼炎和卵黄性腹膜炎等。目前，禽源大肠杆菌的研究资料绝大多数来源于家禽。有关野生禽源大肠杆菌的系统性研究相对较少。但随着集约化养殖的急剧发展和环境污染的加剧，野生禽类也频发此病，对养禽业的发展和野生禽类的保护影响甚大。选取洛阳自然保护区野生成年白鹭进行试验研究，旨在为野生禽类大肠杆菌病的防治和野生动物的保护提供一定参考。

1 材料和方法

1.1 病料

洛阳自然保护区管理处提供的野生成年白鹭的口腔黏液和粪便。

1.2 器材与试剂

超净工作台、恒温培养箱、营养琼脂、糖发酵（分解）试验试剂及指示剂、V-P试验试剂、甲基红（MR）试验试剂、吲哚试验试剂、革兰氏染色液、蛋白胨、牛肉膏等。

1.3 细菌分离与培养

无菌采取疑似病例的粪便和口腔黏液，加入适量生理盐水，在无菌操作台中用接种环接种于麦康凯琼脂平板，在37℃恒温培养箱中培养10～15 h进行培养与分离。

1.4 细菌增殖

无菌操作，将麦康凯培养基中的红色单一菌落接种于LB液体培养基中，37℃摇床培养7～8 h。观察生长状况，放置冰箱保存备用。

1.5 革兰氏染色

无菌操作，用接种环LB液体培养基中的菌液，涂于载玻片上，用酒精灯固定；在已干燥、固定好的玻片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，经1～2 min水洗；加革兰氏碘液与抹片上媒染，经1～3 min，水洗；加95%酒精与抹片上脱色，约1 min，水洗；加10倍稀释石炭酸复红液复染1～2 min，水洗；吸干或烘干，用100倍的油镜进行菌体形态和染色特性的观察；革兰氏阳性细菌呈蓝紫色，革兰氏阴性细菌呈红色［1］。

1.6 生化鉴定

制备生化试验培养基，将分离纯化过的待检菌分别进行糖类发酵试验即生化反应，主要包括蔗糖、麦芽糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、V-P试验、吲哚试验及MR试验。用挑菌环挑取菌液并溶于各生化管中，根据条件的不同放置不同设定的恒温培养箱中，培养24 h或48 h后观察。

1.7 药敏试验

该试验所用方法为CLSI推荐的K-B法进行，将分离纯化鉴定过的待检菌在血清肉汤培养基中37℃下培养12 h，然后用微量移液器取20 μl菌液于LB培养皿中，用L棒涂抹均匀，贴上药敏片，在37℃恒温培养箱内培养15～24 h，再用直尺测量其抑菌环的直径，判断标准参考NCCLS药敏纸片扩散法。抑菌圈直径＞15 mm为高度敏感；在10～15 mm为中度敏感；抑菌圈直径＜10 mm为低度敏感［2］。

2 结果与分析

2.1 培养特性

病原菌在麦康凯琼脂平板上形成的菌落边缘整齐或波形，稍凸起，表面光滑湿润，直径大约2.0 mm，呈红色，因待检菌发酵乳糖而产酸，使中性红指示剂变红色，长出红色菌落。在普通的LB培养基上，则长出表面光滑无色半透明菌落。

2.2 革兰氏染色

在油镜下观察革兰氏染色结果为红色短杆菌，无芽孢和荚膜，单独和成对存在。

2.3 生化鉴定

生化试验结果显示：细菌使甘露醇发酵变为黄色；使鼠李糖、甘油、麦芽糖、甘露糖、乳糖、蔗糖、半乳糖、葡萄糖及棉籽糖发酵变为黄色；该菌具有明胶酶，使明胶水解生成多肽再水解为氨基酸，使明胶液化。该菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚，加入对二甲基氨基苯甲醛试剂时，形成红色的玫瑰吲哚。该菌在分解葡萄糖过程可产生乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，使甲基红指示剂变红。该菌的生化试验结果与大肠杆菌的特征基本一致，见表1。

表1 生化试验结果

2.4 药敏试验

药敏试验结果汇总见表2。

表2 药敏试验结果

3 讨论

该试验通过革兰氏染色确定该分离菌为革兰氏阴性短杆菌，且能在LB培养基和麦康凯培养基上迅速生长，并出现与大肠杆菌一致的生长特征。2010年刘华等人对一株孔雀源大肠杆菌进行分离鉴定，该株孔雀源大肠杆菌的镜检结果为两端钝圆，多数散在排列，偶有2～3个连在一起的革兰氏阴性短杆菌；该菌株的培养特性为在麦康凯琼脂平板上，形成中等大小，表面光滑湿润的粉红色菌落［3］。其相关试验结果与该次试验结果相一致。2013年李双双等人对兔源大肠杆菌进行鉴定，该菌镜检结果为革兰氏阴性，两端钝圆，呈单个或多个散在排列；该菌在普通培养基上形成表面光滑、边缘整齐、湿润半透明的灰白色圆形突起菌落，在麦康凯琼脂平板上形成红色、中等大小、表面光滑、湿润的单个菌落［4］。因此，根据细菌形态和培养特性的研究，可初步确定该分离株为大肠杆菌。

该试验除采用常规细菌分离培养方法外，还进行了一系列生化鉴定试验以便对其进行进一步的验证，鉴定试验结果为该分离株能利用鼠李糖、甘油、麦芽糖、甘露糖、乳糖、蔗糖、半乳糖、葡萄糖及棉籽糖；V-P试验阴性，MR试验为阳性，吲哚试验阴性。参照《伯杰氏细菌鉴定手册第八版》标准及《肠杆菌科生化鉴定编码手册》，此生化鉴定结果表明该分离株的生化特性与大肠杆菌的生化特性相一致。2015年孙蓉蓉等人对水貂大肠杆菌进行分离鉴定，其生化鉴定试验结果为分离菌均可分解葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇，产酸产气，大部分菌株还可利用蔗糖；VP试验阴性，MR试验为阳性，吲哚试验阴性［5］，与该次试验结果相一致。2013年达娃次仁等人对西藏牦牛源大肠杆菌进行分离鉴定，其生化鉴定结果为分离菌能利用葡萄糖、甘露醇、乳糖、蔗糖和麦芽糖；MR试验阳性，V-P试验阴性，吲哚试验阳性［6］，与该次试验结果相一致。至此可基本确定该分离菌为大肠杆菌。

该研究还对待检菌进行了药物敏感性试验，结果表明，该分离菌对青霉素、庆大霉素、环丙沙星、氧氟沙星、链霉素5种药物均为高度敏感。说明该分离株对这几种抗生素的耐药性都比较低，可能是由于该野禽生存和活动的环境抗生素污染并不严重。该次的药敏试验结果可为维护公共卫生安全提供帮助，也可为该保护区野生禽类大肠杆菌病的防治提供依据。

［1］郭伶，代竹青.一例鸡大肠杆菌的分离与鉴定［J］.中国畜牧兽医，2010，37（1）：184-185.

［2］胡仕凤，雷红宇，宁玲忠，等.鸡大肠杆菌病的诊断与防治［J］.养禽与禽病防治，2005，（5）：15.

［3］刘华，祁克宗，朱良强，等.一株孔雀源大肠杆菌分离鉴定与致病特性初步研究［J］.安徽农学通报，2010，16（9）：27-29.

［4］李双双，贺志沛，罗俊娜，等.兔源大肠杆菌的分离鉴定及药物敏感性检测研究［J］.江西农业学报，2013，25（8）：70-72.

［5］孙蓉蓉，邹玲，刘文华，等.水貂大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验［J］.安徽农业科学，2015，43（11）：125-126.

［6］达娃次仁，格桑卓玛，贡嘎，等.牦牛源大肠杆菌西藏分离株的血清型鉴定［J］.黑龙江畜牧兽医，2013，62（21）：160-161.

S852.61+2

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1004-5090（2017）08-0010-02

2017-06-25）