黔产绿茶中多酚类物质的含量分析

罗亚男 杨永刚 王道平

(1.黔南民族医学高等专科学校； 2.湄潭银柜山茶业有限公司 ； 3.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室)

黔产绿茶中多酚类物质的含量分析

罗亚男1杨永刚2王道平3*

(1.黔南民族医学高等专科学校； 2.湄潭银柜山茶业有限公司 ； 3.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室)

用高效液相色谱法建立一种成品绿茶中多酚类物质含量的分析方法。采用C18型色谱分析柱，流动相0.1%磷酸-甲醇梯度洗脱，流速1.0mL/min，检测波长278nm。结果表明：茶叶中多酚类物质与其它组分的分离效果好，稳定性和灵敏度高，各组分回归方程的相关系数均在0.9999以上。

绿茶；茶多酚；高效液相色谱法

贵州湄潭是重要的有机茶叶之乡，种茶历史悠久，环境条件优越，茶叶口感醇爽、浓厚。湄潭茶叶品质优良，品牌众多，当地以湄潭翠芽为湄潭茶叶代表，着手建立茶叶标准体系。茶叶中多酚类物质总称茶多酚(Tea-Polyphnenols)，主要包括表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素(EGC)、没食子儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)等。茶多酚的检测就是该标准体系内容之一，文献记载其含量测定常用方法有高效液相色谱法、紫外分光光度法、近红外光谱法等[1～6]，其中高效液相色谱法因分离效果较好、定量准确而广泛应用于多酚类化合物的检测。由于茶多酚具有抗氧化、抗肿瘤、抗衰老以及降血压、调血脂、降血糖等显著生物活性[7]，也是当前食品、医药领域研究的热点。

采用高效液相色谱仪对茶多酚测定方法进行稳定性、精密度、重复性及回收率实验，建立了黔产茶叶中多酚类物质含量的分析方法，该方法灵敏度高，重复性好，检测快速准确，对茶叶产品的生产加工及质量保证提供技术支持，也是建立湄潭茶叶标准体系内容之一。

1 仪器与试药

1.1 仪器

美国安捷伦公司1260高效液相色谱仪；梅特勒-托利多十万分之一电子分析天平(AG285型)；江苏昆山超声波提取器(BRANSON200型)。

1.2 标准物及试剂

标准品表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)购自中国生物药品检定所；甲醇色谱级；EDTA、抗坏血酸为分析纯；无水乙醇；分析级磷酸；水为双蒸超纯水。

稳定溶液：分别将500 mL无水乙醇、50 mL抗坏血酸(10.0mg/mL)和50 mLEDTA(10.0mg/mL)混合，添加双蒸超纯水至1 000.0 mL，摇匀，备用。

1.3 供试样品

由湄潭银柜山茶业有限公司提供，包括银柜湄潭翠芽(特级)、银柜湄潭翠芽(一级)、银柜毛尖。

2 方法与结果

2.1 流动相

以甲醇和0.1%磷酸作流动相，采用梯度洗脱程序，可在45min内完成多酚类物质的分离。

2.2 对照品溶液的制备

分别称取4种对照品适量，置于容量瓶中，加稳定液溶解、定容，制成浓度分别为56.02μg/mL、75.11μg/mL、371.25μg/mL、392.75μg/mL的表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的混合对照品溶液。4种对照品的PHLC色谱图如图1。

2.3 供试品溶液的制备

试验过程中比较了不同提取方法(超声、回流及索氏提取)和不同提取时间(0.5h、1.0h、1.5h)对提取效果的影响，结果显示采用水浴提取1h即可得到最高提取率。由于茶多酚不稳定，极易氧化，所以试验中添加了EDTA和抗坏血酸作抗氧化剂。

精密称取经干燥磨成细粉的银柜湄潭翠芽(特级)0.50 g，置于锥形瓶中，加入50mL 稳定液，称重，水浴加热回流提取1h，冷却，补重。过滤后，吸取5 mL滤液稀释至10 mL容量瓶中，稳定液定容，过0.45μm微孔滤膜，进样分析。样品的HPLC色谱如图2。

2.4 方法与结论

2.4.1 线性关系

精密吸取一定量的茶多酚混合对照品溶液，用稳定液梯度稀释成标准系列溶液。取5 μL注入液相色谱仪中，测定其峰面积，以峰面积值(y)为纵坐标，进样量(x)为横坐标作图，得到一条不经过原点的直线，四个指标的回归方程见表1，结果表明，几种多酚物质进样量在设定范围内与峰面积呈良好的线性关系。

图1 4种儿茶素混合对照品的HPLC色谱图

图2 样品的HPLC色谱图

标准物回归方程R2表没食子儿茶素(EGC)y=242.06x-0.9758R2=0.9998表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)y=1389.9x-19.105R2=0.9999表儿茶素(EC)y=585.71x-1.50R2=0.9996表儿茶素没食子酸酯(ECG)y=1789.1x-12.205R2=1.0000

2.4.2 稳定性试验

取银柜湄潭翠芽(特级)作供样品，按前述样品处理方法制备供试液，分别在0h、2h、4h、8h、12h、24h测定4种儿茶素峰面积，RSD值分别为1.27%、1.98%、0.54%、1.03%，说明供试品溶液在24h内稳定性良好。其峰面积变化情况见表2。

2.4.3 精密度试验

取标准品溶液作供试样品，连续进样5次，每次5μL，4种儿茶素峰面积的RSD值(n=5)为1.01%、0.32%、2.03%、0.45 %，说明设备精密度良好。

2.4.4 重复性试验

精密称取银柜湄潭翠芽(特级)细粉6份，按前述样品处理方法制备供试液，测定4种儿茶素含量，RSD值分别为0.11%、0.98%、1.36%、0.52%，说明方法的重复性良好。

2.4.5 回收率试验

根据重复性试验的结果，回收率试验分两组进行，每组各6份，按样品处理方法制成供试溶液，EC、EGC回收率平均值为102.31%、103.52%， RSD值(n=6)分别为2.89%、3.24%。ECG、EGCG回收率平均值为101.36%、98.39%， RSD值(n=6)分别为2.85%、1.78%，所得回收率RSD值符合要求，表明该处理方法有效可行。

2.5 数据验证

按样品制备项下方法，分别制备三种茶叶样品的供试液，精密吸取10μL注入液相色谱仪，以外标法计算样品中儿茶素的含量，结果显示试验重现性良好、结果准确、实验操作便捷可行，结果见表3。

表2 4种儿茶素稳定性试验

表3 茶叶样品中4种儿茶素含量

3 讨论

根据检测结果可知，采用该试验的高效液相色谱测定方法，主要检测指标具有良好的分离度和线性关系，该法简单快速准确、灵敏度高、重现性好、检测快速准确，可用于茶叶的质量控制研究。

由于原料、生产工艺及储存条件的不同均会引起茶叶中儿茶素含量的变化，因此，论文中的检测结果仅是体现对该试验方法的论证和探讨，而茶叶等级评定还需结合香气、滋味、氨基酸、咖啡因、微量元素等指标进行综合评价。

[1] 吕生，满红平，姜东华，等．两种方法测定普洱茶中茶多酚含量的比较[J]. 云南大学学报(自然科学版)，2011,S2:461～463.

[2] 丁友昌．分光光度法测定茶多酚保健品中茶多酚[J]．中国公共卫生，1998,14(9): 573.

[3] 焦蓓蓓．茶多酚的药理作用研究进展[J]．亚太传统医药，2009,5(1):131～133.

[4] 王丽丽，陈键，宋振硕，等．茶叶中没食子酸、儿茶素类和生物碱的HPLC检测方法研究[J]．福建农业学报,2014,29(10):987～994.

[5] 潘滋书，袁红雨，龚国强．信阳绿茶茶多酚含量及浸出率[J].信阳师范学院学报(自然科学版)，1995，8(3)：294～298.

[6] 陈惠衡，傅冬和，施玲，等．儿茶素稳定性研究[J]．食品研究与开发，2009，30 (4)：10～12．

[7] 陈华才，吕进，俸春红，等．近红外光谱法测定茶多酚中总儿茶素含量[J]．中国计量学院学报，2005,16 (1):17～20.

贵州省卫生厅科技基金项目gzwkj2010-1-069；黔南州科技局科技计划项目(2010)22号；黔南民族医学高等专科学校科研基金项目黔南医专校字(2009)80号；中药、民族药创新研究平台及能力建设: 黔科中引地(2016)4004号。

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