多粘类芽孢杆菌研究进展

田宇曦　闵勇　杨自文

摘要：多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）是重要的根际有益生物，也被用于生物医药、流程制造、生物修复等方面，具有较大利用价值。综述了多粘类芽孢杆菌的菌株新特性和基因组特点、诸多功能领域的研究和产业化应用、分子操作系统、菌株的选育以及发酵技术的优化。

关键词：多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）；功能；产业化应用；分子操作系统；菌株选育；发酵条件优化

中图分类号：S917.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）18-3401-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.18.001

Abstract： Paenibacillus polymyxa is an important beneficial rhizosphere organism， which may also be applied in biomedical industry， process manufacturing， bioremediation and so on， with great value of utilization. The new characteristics of bacterial strain and genome， study and industrial application in many functional areas，molecular operating system，breeding of strain and optimization of fermentation technology of Paenibacillus polymyxa were summarized.

Key words： Paenibacillus polymyxa； function； industrial application； molecular operating system； breeding of strain； optimization of fermentation condition

類芽孢杆菌属（Paenibacillus）是广泛存在于自然界的一类好氧-兼性厌氧、可产生内生孢子的杆状细菌。多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）是类芽孢杆菌的模式菌种，是一类重要的根际有益细菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）[1]，兼具促进植物生长和生物防治的作用，在生物医药、流程制造、生物修复等方面有重要利用[2]。多粘类芽孢杆菌可产生多种生物活性物质，如酶、抗菌物质、植物生长调节剂及絮凝剂等，多是蛋白质、多糖、多肽[3]。为了从多粘类芽孢杆菌获得更多的活性物质，一般采用诱变和筛选技术选育优良菌株[4]，进行发酵条件优化，菌株的制剂化、复合使用方案等也皆有研究。随着生物技术的不断发展，多粘类芽孢杆菌分子操作也在进一步完善，为多粘类芽孢杆菌功能和分子机理的研究、改造菌株打开了新的天地。

1 菌株新特性及基因组特点

研究发现，多粘类芽孢杆菌细菌细胞可以从玉米、黄瓜等植物的根部转移到茎部和叶部，和革兰氏阴性固氮菌巴西固氮螺菌Yu62、革兰氏阳性菌巨大芽孢杆菌的定植模式相似，可成为一种联合固氮菌[5]。多粘类芽孢杆菌的菌落会发生分化，研究表明，多粘类芽孢杆菌GBR-1在不同的接种浓度下分离的菌落形态有较大的差异，多粘类芽孢杆菌SC2在实验室培养条件下菌落形态也表现出不稳定性。SC2的频繁分化影响了它的应用，分化的突变株不再产生芽孢且抗病能力下降很多。目前，对多粘类芽孢杆菌的分化现象还少有全面的研究，研究其分化机制很有必要。侯晓阳[6]发现SC2分化后的突变株表型变化与基因组变化有关。

到2011年4月30日，完成全基因组测序的微生物共有1 545株，正在进行的微生物基因组测序项目有4 856个，已经完成测序的真细菌全基因组共有893个。其中已测序的模式微生物有大肠杆菌K12[7]、枯草芽孢杆菌[8]等，迄今为止已完成及正在进行测序的类芽孢杆菌菌株有14株，目前已经公布序列的多粘类芽孢杆菌菌株有多粘类芽孢杆菌E681和SC2。多粘类芽孢杆菌SC2注释的抗生素合成和促生相关基因有Fusaricidin、Lantibiotic、 Microcystin、Bacillorin、Inturin、Bacitracin、Polyketide、Gramicidin S、Polymyxin等，其大多与非核糖体肽和聚酮类化合物合成相关。多粘类芽孢杆菌SC2产生的非核糖体肽作为次级代谢产物，具有多样性和统一性，使得该杆菌具有广谱抗菌能力。随着20世纪70年代开始研究肽生物合成非核糖体机制，以及全基因组测序的开展，越来越多的次级代谢产物合成的相关基因被克隆和分析，产生了大量关于次级代谢产物合成和调控的信息[6]。李舒清[9]确定多粘类芽孢杆菌SQR-21的Fusaricidin启动子的最小功能区域，发现宿主存在不同的转录调控因子，导致不同的启动子片段在不同宿主存在不同的转录水平。

2 功能领域的研究和产业化应用

多粘类芽孢杆菌具有促生长和生物防治两方面作用，通过固氮、溶解磷、获取铁和产生植物生长调节剂促进植物生长；通过诱导植物产生系统抗性、产生杀虫或杀菌物质，如抗菌肽、细菌素、非核糖体合成的脂肽、环状阳离子脂肽或非环状阳离子脂肽等，实现生物防治[2]。它产生的微生物多糖，如黄原胶、结冷胶等，也颇具产业价值，广泛应用于工、农业。蹇华丽等[10]研究多粘类芽孢杆菌PS04多糖结构，从一级结构鉴定其为果聚糖。多粘类芽孢杆菌在医药、加工、生物修复等方面也有一定研究[2]。尹艳[11]发现多粘类芽孢杆菌可以降解转化褐煤，并采用正交试验研究褐煤微生物的影响因素，优化了降解方案。宿燕明等[12]发现，施氮肥时添加多粘类芽孢杆菌发酵液，能明显降低油菜中硝酸盐含量。徐匆等[13]将多粘类芽孢杆菌用于桂味荔枝果实采后保鲜，辅以0.3 g/L纳他霉素、1%乳酸钠复配成生物保鲜剂，能显著提高果实的商品率，延长货架期，证实多粘类芽孢杆菌dgnkzx004对荔枝炭疽病菌及霜疫霉菌生长有抑制作用。endprint

多粘类芽孢杆菌在生产实践中的应用方面，学者做了探索。Hu等[14]发现井冈霉素和多粘类芽孢杆菌防治水稻纹枯病有明显的协同效应，以3%井冈霉素A加多粘类芽孢杆菌水剂（2亿芽孢/mL），对水稻纹枯病发病的初期预防效果良好。尹薇等[15]将腐殖酸与多粘类芽孢杆菌配合施用，提高肥料的效果，减轻了土传病害，提高了黄瓜产量。在动物保健方面，多粘类芽孢杆菌被应用于微生态制剂。微生态制剂是调整并稳定肠道微生态平衡，提高宿主健康水平的有益菌群及其代谢产物和选择性促进宿主正常菌群生长制剂的总称，以多功能、绿色无害、无残留的特性成为饲用抗生素的完美替代品。张宏福[16]将多粘类芽孢杆菌A11和枯草芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌混合成新型微生态制剂，该制剂各菌株具有一定的耐受性且对动物的生产性能具有显著的改善作用，对细胞因子和抗氧化因子也有一定的促进作用。刘振华[17]发现，多粘类芽孢杆菌的田间应用适宜采用高芽孢含量发酵液制成的可湿性粉剂，可作为一种广谱性微生物农药，有效防治多种植物土传病害和叶部病害。多粘类芽孢杆菌多糖在农药制备方面，有助悬浮、热保护和紫外保护功能，研究此多糖作为微生物农药专用助剂，可优化可湿性粉剂配方和加工工艺，降低生产成本，具有较大的经济效益和社会效益。

3 分子操作系统

多粘类芽孢杆菌是一种相对研究较少的实验菌，分子遗传学工具相对缺乏，尚处在探索阶段，其分子机制的研究进展尚未深入。近几年其工具和理论方法的研究速度明显地加快。

3.1 常规克隆和表达

在基因克隆、鉴定、表达和应用分析方面，多粘芽孢杆菌诸多功能基因被克隆和延伸研究，比如多糖水解酶基因、β-葡聚糖酶基因、吲哚-3-丙酮酸脱羧酶基因、Fusaricidins基因簇、多粘菌素合成酶基因簇等[18]。陈雪丽等[19]采用硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-50柱层析，采用抑菌活性和SDS-PAGE跟踪检测，从多粘类芽孢杆菌代谢产物中分离纯化到一种对大豆立枯丝核菌具有拮抗活性的大小为35.4 kD的抗菌蛋白。多粘类芽孢杆菌产β-1，3-1，4-葡聚糖酶是一类有着广泛应用前景的饲料添加剂，还有抗稻瘟病菌的活性作用，文凤云等[20]从多粘类芽孢杆菌CP7克隆、表达和应用β-1，3-1，4-葡聚糖酶，从基因工程角度证明了β-1，3-1，4-葡聚糖酶是多粘类芽孢杆菌CP7抗真菌的活性组分，为饲用酶制剂的发开研究提供了新思路。

3.2 生物转化

生防菌功能基因研究需简捷高效的基因组改造工具，基因组操作基础是将外源DNA转入细胞并使其与目的DNA发生同源重组。早期是利用Spizizen自然感受态转化法将外源DNA以线性单链的形式导入细胞内，与基因组具有同源性的外源DNA在RecA重组酶的作用下通过重组载体以单交换或双交换方式整合到染色体上。随着研究的深入，电击转化、接合转移、原生质体转化和碱金属离子转化等方法逐渐被建立并用于DNA转化研究[21]。电击转化法广泛应用于革兰氏阴性和阳性细菌中。原生质体转化法应用较多，但也存在缺陷，比如大质粒的转化效率较低，再生培养基要求高。碱金属离子转化法是新发展起来的一种适合芽孢杆菌的转化方法，在枯草芽孢杆菌和短短芽孢杆菌研究中已有使用。采用接合转移法，已有含前毒素基因的质粒从苏云金芽孢杆菌转移到苏云金芽孢杆菌或者蜡状芽孢杆菌、含有内毒素基因的重组质粒从枯草芽孢杆菌或粪链球菌转移到苏云金芽孢杆菌的报道。

3.3 基因敲除

基因敲除是后基因组时代研究生防基因功能的手段，也可以用于去除细菌基因组上的冗余片段。

3.3.1 基因敲除载体的构建方法 基因敲除载体的构建有4种方法：①传统酶切连接。传统酶切连接方法是将待敲除基因的上游和下游DNA片段和抗生素抗性基因片段分别通过酶切和连接的方法克隆到基因敲除载体的多克隆位点。该方法的操作属于分子生物学常规操作，缺陷是工作步骤繁琐，不利于提高工作效率，且受内切酶选择的限制。②使用Sfi I内切酶的酶切连接。Kamper[22]利用特殊的限制性内切酶Sfi I建立了一套相对快速、适用范围广的基因敲除载体构建方法。内切酶Sfi I识别相隔5个任意核苷酸的2组GGCC序列，设计扩增靶标基因的上下游片段和抗生素抗性基因片段引物时，在5′端加入该接头，用Sfi I酶切这些片段并连接后就可得到待敲除基因DNA和抗生素抗性基因片段连接体。③高通量转座子队列法构建基因敲除载体。构建Cosmid或Fosmid基因组文库，通过转座酶促反应将携带筛选标记的转座子随机插入Cosmid或Fosmid破坏其中的基因，带有被转座子破坏基因的Cosmid或Fosmid可作为基因敲除载体。④融合PCR体系构建基因敲除载体。融合PCR技术简便快捷，不需要内切酶消化和连接酶处理就可以实现不同来源DNA片段的体外连接。可将基因的上游片段、抗生素的抗性基因和基因的下游片段的末端设计成反向互补的末端，通过融合PCR方法构建基因敲除载体[23]。

3.3.2 基因敲除的方式 大体可分为定点敲除和随机敲除两类。定点敲除可采用基于自杀性质粒的同源重组、采用λ-Red系统的线性DNA介导的同源重组和位点特异性重组对目的敲除片段进行精确敲除；随机敲除则利用转座子能够随机插入或切离的特性，引起染色體内部同源重组，可以切除两段重复序列之间的染色体DNA序列。在多粘类芽孢杆菌研究中，基因组基因敲除采用较多的是温敏型自杀性质粒[24]及Cre/loxP位点特异性重组系统[21]。

3.4 其他分子操作手段

Han等[25]采用iTRAQ （Isobaric tag for relative and absolute quantitation）技术，在蛋白质组层面研究多粘类芽孢杆菌JSa-9广谱抗革兰氏阳性细菌、丝状真菌的环状脂酯肽抗生素LI-F型肽段AMP-jsa9拮抗蜡状芽孢杆菌的作用模式。endprint

4 菌株选育

菌种选育是发酵产量提高的前提和基础，一般是将菌株经过物理或化学诱变，从中筛选出正突变菌株。紫外线等射线等化学物理方法是常见的诱变手段，等离子体近年也作为诱变方法。这些方法可单独使用，也可组合使用[4]。闫冬等[26]采用亚硝基胍（NTG）、60Co-λ射线和低能N+离子注入3种方法诱变多粘类芽孢杆菌JSa-9，从300株突变株中发现了2株LI-F类抗菌脂肽产量均提高的营养缺陷型菌株，2菌株遗传稳定性良好。有研究者基于代谢工程选育高产菌，如Okonkwo等[27]研究产2，3-丁二醇多粘类芽孢杆菌对高浓度2，3-丁二醇的反应，发现多粘类芽孢杆菌产生2，3-丁二醇的最高浓度为47 g/L，2，3-丁二醇浓度超过极限值60 g/L后多粘类芽孢杆菌会将2，3-丁二醇转化成乙偶姻。因此得出，设计多粘类芽孢杆菌2，3-丁二醇高产菌要克服2，3-丁二醇毒性和消除2，3-丁二醇的降解。還有研究者采用定向进化技术、组合生物合成和合成生物学等改造菌株。左佃光等[28]综述了微生物非核糖体肽组合生物合成的研究策略，如NRPS基因簇的定点突变、NRPS模块的替换、NRPS模块的插入、NRPS模块的删除、NRPS组成模块的“洗牌”以及NRPS基因簇的异源表达。多粘类芽孢杆菌EJS-3是从中药植物组织中筛选分离到，其体外溶栓效果良好，但此菌株纤溶酶活性较低，钱辉等[29]克隆了纤溶酶基因整合到有AOX强效启动子的毕赤酵母中分泌表达，获得了纤溶酶产量是野生菌株2.6倍的重组酵母。

5 发酵技术优化

发酵技术优化一般考虑培养基优化、发酵条件优化和发酵过程优化3个角度。培养基优化主要是选择适宜菌株生长、有利于目的产物大量表达、成本低、后处理工艺简单的培养基，工业生产还要注重培养基原料的稳定性[4]。正交试验（Orthogonal experiment）和响应面分析方法（Response surface methodology）常用于发酵技术优化[30-33]。

多粘类芽孢杆菌是目前发现惟一能高效生产光学纯（R，R）-2，3-丁二醇的天然微生物，李亿等[34]利用玉米粉高效发酵多粘类芽孢杆菌生产（R，R）-2，3-丁二醇。杜敬河等[35]采用单因素试验探索多粘类芽孢杆菌生产甲壳素酶的最佳条件。程爱芳等[36]采用单因素试验和正交试验优化多粘类芽孢杆菌产β-甘露聚糖酶的培养基组分和培养条件。程爱芳等[37]采用单因素试验和正交试验优化多粘类芽孢杆菌HD-1产纤维素酶的培养基组分和培养条件。孙仲奇等[38]为了提高多粘菌素E产量，研究了5种碳源，发现可溶性淀粉有助于延长多粘菌素E的产素期和提高其合成速率。韩俊华等[39]采用响应曲面法优化多粘类芽孢杆菌HT16产生抗菌蛋白的培养基。赵国群等[40]采用新鲜鸭梨渣为主要原料，固态发酵多粘类芽孢杆菌，采用单因素试验法研究培养条件对生长和产芽孢的影响，发现鸭梨渣是多粘类芽孢杆菌良好的固态发酵原料。

6 结语

学者们对多粘类芽孢杆菌功能和应用领域已有比较全面的了解，在其分子生物学作用机制以及菌株的分子生物学改造技术等方面还有较大的研究空间，进一步完善其分子操作系统、相关基础研究，能为其深入利用提供前提条件。目前，多粘类芽孢杆菌的田间应用等领域的产业化推广还存在一些限制条件，需要通过研究加以突破，比如田间应用中多粘类芽孢杆菌易受环境的影响，需深入研究其在复杂土壤环境中的表现。

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