异丙醇双水相提取/GC-ECD测定鱼肉中六六六、滴滴涕残留

鹿泽启，陈泽宇，柳璇，刘永明，韩典峰

(1.烟台农业科学研究院， 山东 烟台 264000； 2.西双版纳出入境检验检疫局， 云南 西双版纳 666100；3.烟台大学化工学院， 山东 烟台 264000； 4.山东省海洋资源与环境研究院， 山东 烟台 264006)

异丙醇双水相提取/GC-ECD测定鱼肉中六六六、滴滴涕残留

鹿泽启1*，陈泽宇2，柳璇1，刘永明3，韩典峰4

(1.烟台农业科学研究院， 山东 烟台264000；2.西双版纳出入境检验检疫局， 云南 西双版纳666100；3.烟台大学化工学院， 山东 烟台264000；4.山东省海洋资源与环境研究院， 山东 烟台264006)

建立了鱼肉中六六六、滴滴涕残留的异丙醇-K2HPO4-H2O双水相提取-气相色谱测定的分析方法。方法研究了异丙醇水溶液体积分数、净化剂对鱼肉中六六六和滴滴涕提取率的影响；确定了六六六的4种异构体的线性范围为0.50～100.00μg/L，滴滴涕的4种异构体的线性范围为1.00～100.00μg/L，鱼肉中六六六、滴滴涕测定回收率为78.6%～104.2%，检出限范围为0.52～1.56μg/kg。该方法快速、高效，适用于鱼肉中六六六、滴滴涕残留的检测。[中国渔业质量与标准，2017，7(5):33-38]

异丙醇；双水相提取；气相色谱；鱼肉；六六六；滴滴涕;残留量

六六六、滴滴涕属于氯代烃类化合物，其性质稳定，能够在环境中持久存在，且可长距离迁移。该类化合物具有致突变、致畸、致癌的效应，能够在生物体内蓄积，最终通过食物链进入人体，对人体造成危害[1-2]。虽然六六六、滴滴涕已于1983年禁用，但在食品、药材等中依然被检出[3-6]，因此开展水产品中有机氯类农药残留的检测，建立新型快速的检测方法同样非常重要。目前，鱼肉中六六六、滴滴涕残留分析的检测方法主要有气相色谱法、气相色谱质谱法、液相色谱串联质谱法，常用的前处理方法有固相萃取法、液液萃取法、凝胶色谱法等[7-11]。传统的样品前处理过程溶剂和能源消耗量较大，易造成环境污染，操作步骤也过于繁琐，不利于六六六、滴滴涕快速检测分析。

双水相提取技术作为近几年发展起来的样品前处理方法，具有试剂消耗量低、能耗小、易操作等优点，广泛应用于天然药物提取、农药残留检测、蛋白质和核酸物质的分离提纯等领域[12-15]。双水相提取技术多采用丙酮、异丙醇、聚乙二醇等水溶性小分子有机物与盐溶液形成双水相体系，使目标物质在两相间选择性分配，从而达到分离的目的[16-17]。本方法利用异丙醇-K2HPO4-H2O双水相提取，优化实验中的提取和净化条件，建立了一种适用于鱼肉中六六六、滴滴涕残留检测的分析方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

GC-2010/ECD气相色谱仪(日本岛津公司)；离心机(日本日立公司)；JJ-2(2003-61)组织捣碎匀浆机(常州市国华电器有限公司)；Milli-Q Gradient超纯水仪(美国Millipore公司)。

正己烷、异丙醇(色谱纯试剂，均购于天津市科密欧化学试剂有限公司)；无水硫酸镁(分析纯，500 ℃马弗炉内烘5 h，购于国药集团试剂公司)；磷酸氢二钾(分析纯，购于上海优浦科学仪器有限公司)；牛血清白蛋白(BSA，分子量为68 000，购于上海洛神生物技术有限公司)；鱼油(500 mL，国药星鲨有限公司)；N-丙基乙二胺硅烷粉剂(PSA，粒径40～50 μm，购于安捷伦生物科技有限公司)；C18粉剂(粒径40～50 μm，购于安捷伦生物科技有限公司)；石墨化碳粉剂(GCB，200～400目，购于安捷伦生物科技有限公司)；实验用水均为超纯水。

六六六的4种异构体(α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC)、滴滴涕的4种异构体(p,p'-DDE、o,p'-DDT、p,p'-DDD、p,p'-DDT)的混合标准溶液(质量浓度100 μg/mL， 4 ℃冰箱内储存)，均购于国家环境保护总局标准样品研究所，编号为SB05-068-2016。

标准溶液的配制：准确移取不同体积的上述混合标准物质溶液，用正己烷配制成1 000 μg/L标准中间液，4 ℃冰箱内储存，临用前正己烷稀释至所需质量浓度。

1.2 仪器条件

色谱柱为DB-1毛细管色谱柱(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气(高纯N2)流速为3.0 mL/min。色谱柱程序升温：初始温度100 ℃，以30 ℃/min升温至210 ℃，保持4 min;以10 ℃/min升温至230 ℃，保持7.5 min。检测器温度为280 ℃；进样口温度为250 ℃。进样量1 μL；进样方式为分流进样，分流比20。

1.3 样品前处理

称取4.00 g鱼肉样品于50 mL离心管中，加入80%的异丙醇水溶液(V/V)20.0 mL，漩涡混匀1 min，浸泡30 min。再加入2.5 g K2HPO4，漩涡混匀1 min，5 000 r/min离心5 min，形成双水相后，转移上层液5.0 mL于15 mL离心管中，加入1.0 g无水MgSO4和100 mg PSA，涡旋振荡后5 000 r/min离心5 min。取上清液4.0 mL于新的15 mL离心管中，40 ℃水浴条件下氮气吹干，正己烷1.0 mL定容，过0.22 μm滤膜，上机测定。

2 结果和讨论

2.1 异丙醇水溶液体积分数对六六六、滴滴涕提取率的影响

通过向6组阳性样品中分别加入体积分数为60%、 70%、 80%、 90%、 100%的异丙醇水溶液(V/V) 20.0 mL，其余步骤按“1.3样品前处理”操作，测定各组六六六、滴滴涕平均提取率。如图1所示， 80%的异丙醇水溶液(V/V)对六六六、滴滴涕的提取效率高于其他对照组，分析原因为高体积分数的异丙醇水溶液使鱼肉蛋白质快速变性，导致六六六、滴滴涕被蛋白质包裹，不能有效提取；低体积分数的异丙醇水溶液不能引起鱼肉蛋白质彻底变性，同样导致六六六、滴滴涕的提取效率较低。因此，本方法采用体积分数为80%的异丙醇水溶液作为异丙醇双水相萃取鱼肉中六六六、滴滴涕的萃取液。

图1 不同体积分数异丙醇水溶液对六六六、滴滴涕平均回收率的影响(n=5)Fig.1 The effects of isopropanol alcohol aqueous solution volume-volume percentage on average recoveries of HCHs and DDTs(n=5)

2.2 盐成分对双水相体系提取效果的影响

图2 不同盐添加量对o,p'-DDT平均提收率的影响(n=5)Fig.2 Effects of different content of salt on the average extraction ratio of o,p'-DDT(n=5)

2.3 不同净化剂对六六六、滴滴涕提取率的影响

目前，双水相提取方法常用的净化试剂有PSA、C18、GCB、高分子多孔微球系列[20-22]，主要干燥试剂为无水硫酸镁[22-24]。本方法对PSA、PSA+GCB (1∶1，m/m)、 PAS+C18(1∶1，m/m)、C18、C18+GCB (1∶1，m/m)5组净化剂的净化效果进行比较。结果显示，各组净化剂均能有效地去除提取液中杂质；C18、 PAS+C18(1∶1，m/m)、 C18+ GCB (1∶1，m/m)为净化剂时对六六六、滴滴涕有一定的吸附作用，提取率偏低；PSA、 PAS+GCB (1∶1，m/m)为净化剂时对六六六、滴滴涕的吸附作用可以忽略，提取率较高(图3)。经过对比实验，确定100 mg PSA作为净化剂能有效地去除提取液中杂质。

图3 不同净化剂对六六六、滴滴涕回收率的影响(n=5)A为100 mg的PSA；B为100 mg的PSA+GCB(1∶1，m/m)；C为100 mg的PAS+C18(1∶1，m/m)；D为100 mg的C18；E为100 mg的C18+GCB(1∶1，m/m)。Fig.3 Effects of different decontaminants on the average recoveries of HCHs and DDTs(n=5)(A)PSA，100 mg；(B)PSA+GCB(1∶1，m/m)，100 mg；(C)PAS+C18(1∶1，m/m)，100 mg；(D)C18，100 mg；(E)C18+GCB(1∶1，m/m),100 mg.

2.4 方法的线性范围、检出限及加标回收率

用正己烷分别配制不同质量浓度的六六六、滴滴涕标准溶液，其中4种六六六标准溶液浓度依次为0.50、 1.00、 5.00、 20.00、 100.00 μg/L，4种滴滴涕标准溶液浓度依次为1.00、 5.00、 10.00、 20.00、 100.00 μg/L，进行GC-ECD上机测定，结果表明，六六六、滴滴涕标准曲线呈良好的线性关系，相关系数R均大于0.990(表1)。依本研究确立的方法，对空白鱼肉低浓度加标进行测定，以GC-ECD信噪比≥3为检出限，得到本方法六六六、滴滴涕检出限范围为0.52～1.56 μg/kg。采用本方法在两个浓度水平对空白鱼肉样品进行加标测定(空白及加标谱图见图4)，回收率为78.6%～104.2%，相对标准偏差(RSD)为2.5%～7.5%。具体结果见表1。

图4 鱼肉样品空白色谱图(A)与加标(5.00 μg·kg-1)色谱图(B)Fig.4 Blank chromatogram (A) and spiked chromatogram (B, 5.00 μg·kg-1) on fish sample

表1 线性范围及方程、相关系数、保留时间、检出限、加标水平、回收率和相对标准偏差Tab.1 Linear range and equations, correlation coefficients, retention time, Limit of detection (LOD),spiked levels, average recovery rate and relative standard deviation(RSD)

n=5

3 结论

本研究建立了异丙醇-K2HPO4-H2O双水相体系提取，气相色谱仪测定鱼肉中六六六、滴滴涕的检测方法。方法确立了向样品中加入20.0 mL 80%的异丙醇水溶液(V/V)和2.5 g K2HPO4形成双水相体系对鱼肉中六六六、滴滴涕有较高的提取率，在提取液中添加100 mg PSA颗粒净化剂可实现较好的净化效果。方法中，六六六的4种异构体线性范围为0.50～100.00 μg/L，滴滴涕的4种异构体线性范围为1.00～100.00 μg/L，六六六、滴滴涕的检出限范围为0.52～1.56 μg/kg，测定六六六、滴滴涕在两个加标水平上回收率为78.6%～104.2%，相对标准偏差为2.5%～7.5%。该方法有机试剂使用量少，操作简单、高效，适用于鱼肉中六六六、滴滴涕的检测。

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DeterminationofHCHsandDDTsinfishbyisopropanolaqueoustwo-phaseextractionandGC-ECD

LU Zeqi1*, CHEN Zeyu2, LIU Xuan1, LIU Yongming3, HAN Dianfeng4

(1.Yantai Agricultural Science and Technology Institute, Yantai 264000, China; 2.Xishuangbanna Entry-Exit Inspection andQuarantine Bureau, Xishuangbanna 666100, China; 3. College of Chemical Engineering, Yantai University, Yantai 264000, China;4. Shandong Marine Resource and Environment Research Institute, Yantai 264006, China;)

A method for the determination of HCHs and DDTs in fish by isopropanol-K2HPO4-H2O aqueous two-phase extraction and gas chromatography was established The method investigates the effects of isopropanol alcohol aqueous solution volume fraction and decontaminants on extraction ratio of HCHs and DDTs. The HCHs showed good linearity in range of 0.50～100 μg/L, and the DDTs showed good linearity in range of 1.00～100 μg/L. The average recovery rate of HCHs and DDTs ranges from 78.6%～104.2% and the limit is 0.52～1.56 μg/kg. In conclusion, the method is rapid, effective and applicative for the analysis of HCHs and DDTs residue in fish [Chinese Fishery Quality and Standards，2017，7(5)：35-38].

isopropanol; aqueous two-phase extraction; gas chromatography electron capture detection (GC-ECD); fish；Hexachloro-cyclohexane (HCHs); Dichloro-diphenyl-trichloroethane (DDTs);resdiue amount

LU Zeqi, yantgongz@126.com

10.3969/j.issn.2095-1833.2017.05.005

S91

A

2095-1833(2017)05-0033-06

2017-05-22;接收日期2017-07-05

山东省现代农业产业技术体系创新团队(SDAIT-12-08，SDAIT-26-05)

鹿泽启(1979-)，男，硕士，农艺师，研究方向为农药残留检测，yantgongz@126.com