玫烟色棒束孢SCAU-IFCF01产酶特性研究

雷妍圆，吕利华，何余容

(1.广东省农业科学院植物保护研究所/广东省植物保护新技术重点实验室，广州 510640；2.华南农业大学农学院，广州 510642)

玫烟色棒束孢SCAU-IFCF01产酶特性研究

雷妍圆1，吕利华1，何余容2*

(1.广东省农业科学院植物保护研究所/广东省植物保护新技术重点实验室，广州 510640；2.华南农业大学农学院，广州 510642)

采用3, 5-二硝基水杨酸(DNS)法、琼脂平板透明圈法和专一性短肽底物Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA对玫烟色棒束孢Isariafumosorosea5个菌株在培养液、虫体诱导下的几丁质酶和凝乳弹性蛋白酶(Pr1酶)活性进行了研究。结果表明，玫烟色棒束孢在不同诱导源中均能产生几丁质酶和Pr1酶。DNS和透明圈比值法测得的各菌株间几丁质酶活性差异趋势一致，高致病力菌株IFCF01的几丁质酶产酶水平显著高于4个低致病力菌株。以虫体诱导的菌株IFCF01几丁质酶活性最高达0.7815 IU/mL，显著高于培养液诱导的0.3740 IU/mL。玫烟色棒束孢Pr1酶活性随接种时间逐渐增高，且高致病力菌株产酶量显著高于低致病力菌株。以虫体培养的菌株IFCF01 Pr1酶活性最高值达2.34 μg/mL/min，显著高于IFCF-D58的最高值0.88 μg/mL/min。虫体诱导对几丁质酶和Pr1酶活性有明显的促进作用，推测与小菜蛾Plutellaxylostella幼虫表皮含有刺激玫烟色棒束孢大量产酶的成分有关。

玫烟色棒束孢；小菜蛾；几丁质酶；凝乳弹性蛋白酶；酶活性

昆虫病原真菌(Entomopathogenic fungi)作为农林害虫生物防治的一个重要组成部分，在持续控制害虫、保护生态平衡方面具有不可替代的作用。尽管利用昆虫病原真菌生物防治害虫已经取得了一定的成效，但与化学农药相比，却普遍存在杀虫速率缓慢、防效不稳定等弱点(蒲蛰龙, 1985; de Faria and Wraight, 2007; 王记祥和马良进, 2009; 王联德等, 2010)。

病原真菌侵染寄主昆虫的第一道屏障是表皮，在降解表皮过程中，真菌分泌产生多种胞外水解酶，包括蛋白质酶、几丁质酶、脂酶、淀粉酶等(Charnley and Leger, 1991)，这个过程一般认为是在酶的降解和芽管的机械压力共同作用下完成的(St Leger, 1987)。昆虫外骨骼的两种主要组成成分是几丁质和蛋白质(杨革等, 2005)，因此胞外蛋白酶和几丁质水解酶是菌株非常重要的毒力因子，其产酶活性高低是菌株毒力的重要因素(Kaur and Padmaja, 2009)。多年来关于昆虫病原真菌酶活与毒力间相关性的探讨，由于菌株或实验方法的差异，至今仍处于各持己见的阶段。多数观点认为菌株的一系列胞外水解酶与其对寄主毒力间呈正相关(樊美珍等, 1991; 胡景江等, 1996; 彭国雄等, 2000; 林海萍等, 2008; 殷红福等, 2011; 董晶等, 2015)。也有观点认为，胞外蛋白酶活性与其毒力相关性虽然显著但却是有限的，在统计学意义上不足以将其作为菌株的毒力指标(冯明光, 1998)。

玫烟色棒束孢Isariafumosorosea是一类重要的昆虫病原真菌，能寄生多种蔬菜和果树害虫(陈巍巍和冯明光, 1999; Meyeretal., 2008; Marjorieetal., 2010)。本实验室曾报道一株对小菜蛾Plutellaxylostella具有高致病力的玫烟色棒束孢SCAU-IFCF01(吕利华等, 2007)，该菌株胞外蛋白酶水平与其对小菜蛾的致病力间呈极显著的正相关(雷妍圆等, 2010)，但其产酶特性及与低致病力菌株间的差异仍有待评价。为此，本研究以玫烟色棒束孢IFCF01、IFCF-D、IFCF-D58、IFCF-D20、IFCF-D50为供试菌株，对不同诱导源下的菌株几丁质酶和凝乳弹性蛋白酶(Pr1酶)活性差异进行研究，为利用玫烟色棒束孢进行生物防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试虫源和菌株

供试虫源为室内人工饲养多代的小菜蛾种群，饲养温度为25℃±1℃，相对湿度60%-90%，光照条件L ∶D=14 ∶10，幼虫长至4龄初供试。所用菌株为玫烟色棒束孢高致病力菌株IFCF01(原EBCL 03011或PFCF-O)和低致病力菌株IFCF-D、IFCF-D58、IFCF-D20、IFCF-D50(雷妍圆等, 2010)。各菌株接种于萨氏培养基SDAY(葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，酵母膏10 g，琼脂15-20 g，蒸馏水1 L)平板上，25℃全黑暗条件下培养20 d待用。

1.2 几丁质酶活力测定

1.2.1几丁质酶液制备

胶体几丁质培养液：1%胶体几丁质，基本盐溶液(0.05% KH2PO4，0.05% MgSO4·7H2O，0.05% NaCl，0.001% FeSO4·7H2O)，蒸馏水定容，121℃灭菌20 min。固体培养基在上述液体培养基内加2%琼脂。将各菌株1.0×108孢子/mL浓度的孢子悬浮液接种于几丁质液体培养基，摇床120 r/min，25℃振荡培养3 d后，样液经10000 r/min，4℃离心20 min，取上清液为待测酶液。

虫体诱导液：取60头4龄幼虫，以0.05% Tween-80溶液清洗幼虫，趁虫体未干时将其放入菌体平板上，使虫体表面沾满分生孢子，然后将幼虫移至有新鲜甘蓝叶的培养皿中饲养，在接种16 h后(雷妍圆等, 2011)，将虫体身上的分生孢子用基本盐溶液洗下来，收集足够体积后调整孢子浓度为108孢子/mL，离心取上清液为待测酶液。

1.2.2几丁质酶活性测定方法

氨基葡萄糖标准曲线：分别配制(100、200、300、400、500)μg/mL氨基葡萄糖溶液，测OD值，绘制标准曲线。

1.2.2.1 3,5-二硝基水杨酸(DNS)法

参照王庆云等(2006)方法配制DNS。将上述获得的酶液于37℃预热3 min，取2 mL离心管分别加入200 μL酶液和200 μL胶体几丁质，混合均匀后置于37℃水浴60 min，再往离心管中加入400 μL DNS，沸水加热10 min。10000 rpm离心10 min，530 nm测OD值。另取一管作为对照，先将酶液沸水煮5 min使酶失活，其余步骤相同。处理和对照各重复3次。酶活性计算公式为：

酶活力单位(IU/mL)=5 A·K·n/t

式中t为反应时间；A为样品中平行试验的平均吸光度；K为吸光常数，由标准曲线得出，数值上等于A为1时所相当的μg数；n为测定样品时的稀释倍数。酶活力单位(IU/mL)为每1 mL酶液每1 min水解脱乙酰胶体几丁质产生1 μg氨基葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位。

1.2.2.2 平板透明圈法

几丁质固体培养基定量15 mL制成几丁质胶体-琼脂平板。用1 mm2灭菌滤纸片沾取孢子悬浮液，25℃黑暗培养10 d后，以5%的NaOH溶液处理平板，菌落的周围即显示出清晰透明的环状，这是由于玫烟色棒束孢产生的几丁质酶分解了胶体几丁质所致，用十字交叉法测量透明圈和菌落直径，以两者比值r表示产酶水平。重复3次。

1.3 弹性蛋白酶Pr1活力测定

1.3.1弹性蛋白酶Pr1酶液制备

明胶培养液：用0.05% Tween-80溶液洗下平板的分生孢子，四层擦镜纸过滤，滤去菌丝等碎片，12000 r/min离心10 min。灭菌水洗涤2次，同上离心收集孢子，然后将孢子接种于明胶液体培养基(1%明胶，基本盐溶液(0.03% NaCl，0.03% K2HPO4和0.03% MgSO4·7H2O))(胡景江等, 1996)，调整孢子浓度为108孢子/mL。摇床120 r/min，25℃振荡培养，分别在4 h、8 h、16 h、24 h取样，离心取上清液为待测酶液。

虫体诱导液：取200头4龄幼虫，以0.05% Tween-80溶液清洗幼虫，趁虫体未干时将放入菌体平板上，使虫体表面沾满分生孢子，然后将幼虫移至有新鲜甘蓝叶的培养皿中饲养，分别在接种后4 h、8 h、16 h、24 h、48 h和72 h将虫体身上的孢子用基本盐溶液洗下，收集足够体积后调整孢子浓度为108孢子/mL，离心取上清液为待测酶液。

1.3.2弹性蛋白酶Pr1活性测定方法

各菌株Pr1酶活性分析参照St Leger等(1996)方法测定。以短肽Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA为专一底物，10 μL底物(1 mM)加入30 μL Tris-HCl(pH7.95，0.1 M)和10 μL酶液，在25-28℃下反应5-10 min，于紫外光分光光度计(Shimadzu UV-1800)测A410值。重复3次。Pr1产生水平以A410/mL/min表示。

1.4 数据处理

用DPS数据处理系统(唐启义和冯明光, 2002)的邓肯氏新复极差法(Duncan’s multiple range test, DMRT)进行差异显著性分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 标准曲线绘制

由氨基葡萄糖标准曲线求得线性回归方程为y=0.0015 x+0.0078，R2=0.9953，说明在已知浓度范围内有良好的线性关系(图1)。

图1 氨基葡萄糖标准曲线Fig.1 The standard curve of glucosamine

2.2 玫烟色棒束孢的几丁质酶水平

分别以DNS和琼脂平板透明圈法测定的几丁质酶产酶水平如表1。在不同诱导源下，各菌株间几丁质酶活性有显著差异，分别以培养液和虫体诱导的酶活由高到低排列皆为IFCF01>IFCF-D58>IFCF-D20>IFCF-D50>IFCF-D。同一菌株在不同诱导源下产酶活性也存在不同程度差异，尤其体现在菌株IFCF01和IFCF-D58上，表现为虫体诱导产生的酶活显著高于培养液诱导。几丁质胶体-琼脂平板上，各菌株的透明环的直径与菌落直径的比值r之间存在显著差异，几丁质酶水平变化范围为1.03-1.56，以r的大小作为菌株产几丁质酶水平的大小排列为IFCF01﹥IFCF-D58﹥IFCF-D20﹥IPFCF-D50﹥IFCF-D。DNS法与透明圈比值法测得的各菌株间几丁质酶活性差异趋势一致。

表1 菌株在不同诱导源下的几丁质酶活性

注：表中数据为平均值±标准误，同一列数据后不同小写字母表示经DMRT检验差异显著(P<0.05)，同一行数据后不同大写字母表示经DMRT检验差异显著(P<0.05)。Note: Data in a column (row) are presented as Mean±SE, followed by different small (capital) letters indicate significant difference (P<0.05) by DMRT test.

2.3 玫烟色棒束孢的Pr1酶水平

以高致病力菌株IFCF01和低致病力菌株IFCF-D58为例，两个菌株在虫体诱导后的4-24 h间均可产生Pr1酶，但酶活性存在差异(图2)。随着接种时间的增加，各菌株的Pr1酶活性皆逐渐增高，且菌株IFCF01的产酶量在各时期均显著高于IFCF-D58。产酶量最高值出现在接种后24 h，该时期IFCF01的Pr1酶活性达2.34 μg/mL/min，IFCF-D58为0.88 μg/mL/min。菌株IFCF01的产酶量增加最快的时期在8-16 h期间，IFCF-D58产酶量增加最快的时期在16-24 h，在产酶时间上后者比前者晚了约8 h。

2.4 不同诱导源下玫烟色棒束孢IFCF01的Pr1酶水平

分别以明胶液体培养基和虫体诱导高致病力菌株IFCF01，随接种时间进程其Pr1酶活性变化如图3。从产酶速度来看，经虫体诱导后产酶量增加最快的时期在8-16 h。从产酶量来看，菌株在虫体上各时期的产酶量均显著高于明胶培养基，虫体诱导的Pr1酶最大产量比明胶液体培养基诱导的最大产量高出约2倍。此外，菌株IFCF01在虫体上与明胶液体培养基中的产酶方式不完全相同。接种至虫体后酶活性一直上升，而接种至明胶液体培养基48 h内活性上升，至72 h出现下降。

图2 玫烟色棒束孢IFCF01和IFCF-D58在虫体上的连续产Pr1酶情况Fig.2 The Pr1 activity of Isaria fumosorosea IFCF01 and IFCF-D58 induced by Plutella xylostella larvae注：图中数据为平均值±标准误，不同小写字母表示经DMRT检验在0.05水平上差异显著。图3同。Note: Data are presented as Mean±SE, different superscripted small letters indicate significant difference (P<0.05) by DMRT test. Same to Fig.3.

图3 玫烟色棒束孢IFCF01在明胶液体培养基和虫体上的连续产Pr1酶情况Fig.3 The Pr1 activity of Isaria fumosorosea IFCF01 induced by Plutella xylostella larvae and gelatin culture medium

3 结论与讨论

昆虫病原真菌侵染寄主，从分生孢子萌发到菌体重新在虫体上产生孢子的过程，可大致分为体表吸附萌发、体壁穿透和体内定殖等三个阶段。孢子穿透表皮需通过合成、分泌一系列胞外水解酶来分解表皮结构成分以完成入侵(Cole and Hoch, 1991)，还必须克服昆虫体壁上包括抗菌肽、脂肪酸和其它一些物质的抑菌作用(Latgéetal., 1987)。一般最先产生蛋白酶降解蛋白质，使几丁质和脂类物质裸露于蛋白间隙，再分泌几丁质、脂酶等降解几丁质、脂类等物质，酶的作用消除了孢子入侵屏障的同时，还给真菌入侵提供了营养(付志坚等, 2000)。

多项研究结果表明，昆虫病原真菌的致病性与胞外水解酶系的作用密切相关(樊美珍等, 1991; 胡景江等, 1996; 彭国雄等, 2000; 林海萍等, 2008; 殷红福等, 2011; 董晶等, 2015)。从本研究结果来看，用DNS法和琼脂平板透明圈法测得的5个玫烟色棒束孢菌株间几丁质酶活性差异趋势一致，皆表现为菌株致病力与酶活水平成正比。经虫体诱导后，各菌株的几丁质酶活性较培养液培养有不同程度的增高，表明小菜蛾幼虫体壁含有刺激孢子大量产生几丁质水解酶的成分。研究中供试菌株对小菜蛾4龄幼虫致病力分别为IFCF01﹥IFCF-D58﹥IFCF-D20﹥IFCF-D50﹥IFCF-D(雷妍圆等, 2010)，各菌株在不同诱导条件下测得的几丁质酶产酶水平分别为IFCF01﹥IFCF-D58﹥IFCF-D20﹥IFCF-D50﹥IFCF-D，可见几丁质酶产酶水平与致病力之间有一定的正相关趋势，这与此前胞外蛋白酶产生水平与致病力之间具线性相关的结论较为一致(雷妍圆等, 2010)。虽然虫体对低致病力菌株的酶活性有一定的诱导增效作用，但提高效果有限，可能与孢子活力不佳有关。

玫烟色棒束孢高致病力菌株比低致病力菌株更早产生Pr1酶，表现出更快的产酶速度，说明产Pr1酶速度对侵染速度起着关键作用，其关系到菌株能否在接种初期成功定殖，以进一步侵染和致病寄主。菌株IFCF01在虫体上各时期的Pr1酶产酶量均显著高于明胶培养基，其最大产量约为明胶液体培养基的2倍，说明小菜蛾幼虫表皮成分刺激了孢子大量产酶。受虫体诱导后IFCF01的产Pr1酶量在8-16 h期间有小幅的快速增长，这与此前通过透射电镜观察到该时期分生孢子迅速萌发、形成附着孢和菌丝穿透表皮层等现象相吻合(雷妍圆等, 2011)。明胶液体培养基对Pr1酶的诱导作用有限，到后期Pr1酶活性呈下降趋势，可能是由于固定体积的液体内，菌株分泌的Pr1酶随时间进程逐渐达到饱和状态，最终由合成转为分解，也可能与培养基中营养物质被消耗有关。

以往的研究多采用虫尸粉诱导胞外水解酶(彭仁旺等, 1996; 邱立友等, 2000; 邓彩萍等, 2011)，其诱导效果与虫尸粉来源有关，并且因菌株而异。本研究的玫烟色棒束孢供试菌株孢子粉产量高，可实现活虫诱导，比使用非寄主昆虫的虫尸粉更接近实际侵染效果。尽管包括本研究在内的许多观点认为酶活性与菌株的致病力相关，但仅以一种或几种酶的活性来评定菌株致病力仍缺乏客观性。昆虫体壁成分的复杂性和组织结构的多层次性并存，穿壁过程可能是一个多环节、多步骤、涉及多种因素的分子事件(彭仁旺等, 1996)，昆虫病原真菌侵染寄主是多因素共同作用的结果。本研究仅对不同诱导源下玫烟色棒束孢几丁质酶和Pr1酶活性及各菌株间酶活性差异进行了初步探索，还需从宏观的组学角度、分子生物学和遗传操作等手段作进一步的研究。

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StudyoninductionofenzymeactivityofentomopathogenicfungusIsariafumosoroseaSCAU-IFCF01

LEI Yan-Yuan1, LÜ Li-Hua1, HE Yu-Rong2*

(1. Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection/Institute of Plant Protection, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China; 2. College of Agriculture, South China Agriculture University, Guangzhou 510642, China)

The activity of chitinases and Pr1 protease ofIsariafumosoroseastrains IFCF01, IFCF-D58, IFCF-D, IFCF-D20 and IFCF-D50 was studied under the liquid culture mediums and larvae-induced mediums by DNS method, agar flat method and specific peptide substrate Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA respectively. The results showed that two enzymes could be produced in liquid culture medium and larvae-induced medium. The trends of chitinases activities with the change of determined methods among fiveI.fumosoroseastrains were in good agreements, and the chitinease activity of high-pathogenicity strain IFCF01 was significantly higher than those relative low-pathogenicity strains.I.fumosoroseaIFCF01 could secrete high amounts of extracellular chitinase (0.7815 IU/mL) with larvae-induced mediums, which showed significantly higher than that with liquid culture mediums (0.3740 IU/mL). The changing pattern of Pr1 activity was corresponding in larvae-induced mediums during the inoculation process, and the Pr1 activity of high-pathogenicity strain IFCF01 was significantly higher than that of the relative low-pathogenicity strain IFCF-D58. The highest Pr1 activity of strain IFCF01 reached 2.34 μg/mL/min, which was significantly higher than 0.88 μg/mL/min of strain IFCF-D58. Both chitinase and Pr1 activity increased with the larvae-induced medium, which indicated that the activity of enzymes could be enhanced by some cuticle components ofPlutellaxylostellalarvae.

Isariafumosorosea;Plutellaxylostella; chitinase; Pr1; enzyme activity

雷妍圆，吕利华，何余容.玫烟色棒束孢SCAU-IFCF01产酶特性研究[J].环境昆虫学报，2017,39(5):1000-1006.

Q966;S476

A

1674-0858(2017)05-1000-07

国家自然科学基金青年科学基金项目(31401743)；广东省农业科学院院长基金(201426)

雷妍圆，女，1981年生，博士，助理研究员，研究方向为昆虫生物信息学及分子生物学，E-mail：leiyanyuan@163.com

*通讯作者Author for correspondence, E-mail: yrhe@scau.edu.cn

Received: 2017-03-22; 接受日期Accepted: 2017-05-15