琼榄小孢子发生、雄配子体发育及花粉粒形态

孔冬瑞 李 璐

(1.鲁东大学生命科学学院，烟台 264025； 2.西南林业大学云南生物多样性研究院，昆明 650224)

琼榄小孢子发生、雄配子体发育及花粉粒形态

孔冬瑞1李 璐2

(1.鲁东大学生命科学学院，烟台 264025； 2.西南林业大学云南生物多样性研究院，昆明 650224)

利用光学显微技术和电镜扫描技术研究了琼榄的小孢子发生、雄配子体发育和花粉粒形态以增加广义心翼果科的胚胎学和孢粉学资料。主要结果如下：(1)花药四孢囊；(2)花药壁四层，从外到内分别为表皮、具纤维性加厚的药室内壁、退化早的中层和细胞具2～4核的分泌型绒毡层；(3)小孢子母细胞胞质分裂同时型，形成四面体型排列的小孢子四分体；(4)成熟花粉粒为二细胞型；(5)花粉粒具3个隐形萌发孔，外壁为网状纹饰。琼榄与心翼果属的小孢子发生和雄配子体发育特征非常相似，稍有不同。琼榄的花粉粒形态特征与同属其它种基本相同。

琼榄；小孢子发生；雄配子体发育；花粉粒形态；广义心翼果科

琼榄属(GonocaryumMiquel)为常绿灌木或小乔木，全世界约有10种，分布于东南亚热带地区[1]。我国有琼榄(G.lobbianum(Miers) Kurz)和台湾琼榄(G.calleryanum(Baill.)Becc.)两种，琼榄分布在海南和云南，台湾琼榄仅生长在台湾[1]。在传统的分类系统中，琼榄属一直都是茶茱萸科(Icacinaceae(Bentham) Miers)的成员[2～4]。到了分子时代，琼榄的系统位置发生了较大变化。Kårehed根据对广义茶茱萸科(Icacinaceae s.l.)分支分析的研究结果，把包括琼榄属在内的至少3个原茶茱萸科的属移入单型科—心翼果科(Cardiopteridaceae)，扩大了心翼果科的范围[5]。广义心翼果科(Cardiopteridaceae s.l.)虽然得到普遍认可[6～8]和分子系统研究结果的支持[9～10]，却一直缺少形态学验证。植物胚胎学和孢粉学是广义形态学的重要组成部分，在解决各级分类学问题时都有重要的参考价值[11～12]，但迄今为止，广义心翼果科的胚胎学资料却非常少，已有的资料也主要集中在胚囊发育方面[13～14]。在小孢子发生和雄配子体发育方面，仅Tobe研究了心翼果属心翼果(CardiopterisquinquelobaHassk.)的小孢子发生和雄配子体发育[14]。在孢粉学方面，Dahl以原茶茱萸科的成员研究了琼榄属4个种的花粉粒形态，但琼榄这个种未在研究之列[15]。Schori和Furness在研究冬青目(Aquifoliales)的孢粉学时，对心翼果属、琼榄属等心翼果科各属的花粉粒形态进行了研究，同样没有包括琼榄这个种[16]。我们利用常规石蜡制片技术研究了琼榄的小孢子发生和雄配子体发育，并利用电镜扫描技术，观察了琼榄的花粉粒形态，旨在补充广义心翼果科的胚胎学及孢粉学资料，进而为验证心翼果科的的扩大是否合适提供更多的形态学证据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验材料采自中国科学院西双版纳植物园(引种号为3020020065)。取不同发育时期的花蕾和花朵，固定并保存于FAA固定液(50%乙醇∶乙酸∶甲醛=90∶6∶4)中。

1.2 实验方法

1.2.1 组织切片

爱氏苏木精整体染色后，常规石蜡制片法制片。Olympus DP-70显微摄影系统下观察并拍照。

1.2.2 花粉粒整体光镜观察

从FAA固定液里取即将开放的花蕾，剥出花药，用解剖针刺破花药壁，轻轻挤压出花粉粒，做成水装片，在Olympus DP-70显微摄影系统下观察并拍照。

1.2.3 电镜扫描

取即将开放的花蕾在70%酒精里剥出花药，经梯度酒精和醋酸异戊酯脱水，CO2临界点干燥后，用双面导电胶粘到金属样品台上，用解剖针戳破花药壁，轻轻拨动花药壁，使花粉粒散落到导电胶上，离子溅射仪喷金镀膜后，在Hitachi SC800扫描电镜下观察并拍照。

2 结果

2.1 花药壁发育

琼榄的花为单性花，每朵雄花含有5枚雄蕊，每枚雄蕊的花药具有4个小孢子囊(图1：A)。初步发育成熟的花药壁有四层，由外而内分别为表皮、药室内壁、中层和绒毡层(图1：B)。绒毡层细胞初为单核，后为2～4核(图1：B,C)。在花药壁成熟过程中，中层和绒毡层先后退化。绒毡层退化时原位解体,按照Davis的观点，为分泌型绒毡层[17]。散粉时，花药壁只剩下表皮和药室内壁(图1：D)。表皮细胞被拉伸破裂，只剩下残迹。药室内壁细胞径向壁明显伸长，且具有纤维性加厚(图1：D)。花药开裂方式为纵裂，裂口在两个药室相接处(图1：A箭头所指)。

2.2 小孢子发生和雄配子体发育

小孢子母细胞减数分裂过程中(图1：E～I)，胞质分裂为同时型(图1：G～I)，形成四面体型排列的小孢子四分体(图1：J)。单核花粉粒经历单核靠边期(图1：K)，进行一次不均等的有丝分裂，形成一个小的生殖细胞和一个大的营养细胞(图1：L)。生殖细胞一开始为凸透镜状，紧贴花粉壁(图1：L)，后来逐渐脱离花粉壁，进入营养细胞的细胞质内(图1：M)。成熟花粉粒为二细胞型(图1：N)。

2.3 花粉粒形态

在未成熟的花粉粒的切片中，只能看到一个萌发孔(图1：L，M，箭头所指部位)。花粉成熟时，萌发孔变得不明显(图1：N)。但花粉粒水装片的光学显微观察，部分花粉粒可观测到3个萌发孔(图1：Q)。扫描电镜下琼榄的花粉粒为圆球形，分辨不出极面和赤道面，也观察不到萌发孔。花粉外壁纹饰为网状，网壁有穿孔，具鸡冠状的网脊，网眼形状不规则，内有小柱(图1：L)。

3 讨论

3.1 琼榄花粉粒形态

Dahl使用光学显微镜观察了台湾琼榄、G.gracileMiq.(asG.longeracemosumKing)、G.cognatumElmer和Gonocaryumlitorale(Blume) Sleumer.(as G.fuscum Hochr.)等4个种的花粉粒形态，认为琼榄属的花粉粒具3(偶4)个萌发沟，并指出G.gracile和G.cognatu的花粉粒的萌发沟由于有花粉外壁物质跨过形成“桥”，使萌发沟不明显[15]。Schori和Furness同时使用光学显微镜和扫描电镜观察了G.litorale和G.minus两个种的花粉粒形态，认为这两个种的花粉粒具有3个隐藏的萌发孔[16]。我们使用3种不同的处理方法对琼榄花粉粒的观测结果显示：组织切片中，未完全成熟的花粉粒可观察到一个明显的萌发孔，而成熟的花粉粒萌发孔则不明显；扫描电镜下，在观察的50个花粉粒中，没有找到一个具有明显萌发孔(沟)的花粉粒；而水装片的显微观察，虽然大部分花粉粒观察不到萌发孔或只观察到一个萌发孔，但少数花粉粒可观察到3个萌发孔。根据3种观察结果，我们认为琼榄的花粉粒应该是具有3个隐藏的萌发孔。这和G.litorale和G.minus的情况相同，其外壁的网状纹饰、网脊鸡冠状、网眼内具小柱也和G.litorale和G.minus非常相似[16]。综上所述，花粉粒具有3个隐藏的萌发孔在琼榄属是比较普遍的，Dahl描述琼榄属的花粉粒具三孔沟[15]可能是因为光学显微观察结果不准确。

图1 A.花药横切，显示4个孢子囊，箭头所指为花药开裂时裂口位置；B.四层花药壁，由外到内分别为表皮(ep)、药室内壁(en)、中层(ml)和绒毡层(ta)；C.部分花药壁横切，显示绒毡层细胞具2～4核；D.即将散粉时的花药壁，中层和绒毡层退化，表皮细胞(ep)仅留残迹，药室内壁细胞(en)径向伸长，具纤维性加厚；E～I.小孢子母细胞减数分裂，依次为中期Ⅰ、后期Ⅰ、末期Ⅰ、前期Ⅱ和末期Ⅱ；J.四面体型四分体；K.单核靠边期花粉粒；L.单核花粉粒分裂为一个大的营养细胞和一个小的凸透镜状的生殖细胞。左边为分裂中期的花粉粒，右边为刚分裂为两个细胞的花粉粒；M.生殖细胞进入营养细胞的细胞质内，萌发孔明显；N.成熟花粉粒为二细胞型，萌发孔不明显；O.水装片里的成熟花粉粒，显示3个萌发孔(箭头所指)；P.成熟花粉粒电镜扫描图片，分辨不出极面和赤道面，观察不到萌发孔；Q.花粉粒电镜扫描图片部分放大，显示花粉外壁表面纹饰细节Fig.1 A. Transverse section of the anther showing four microsporangia,the arrow points to the site of the slit; B.The anther wall with four layers: the epiders(ep),the endothecium(en),the middle layer(ml) and the tapetum(ta); C.Part of the transverse section of the anther wall showing one tapetal cell contains 2-4 nuclei; D.Transverse section of the anther wall before shedding showing the remains of the epidermis(ep) and the fibouse endothecium(en) with elongate radial wall; E-I.Meiosis of the microspore mother cell,successively showing metaphase Ⅰ,anaphase Ⅰ,telophase Ⅰ,prophase Ⅱ and telophase Ⅱ; J.Tetrahedral microspore tetrad; K.The pollen grain possesses a large vecuole with the nucleus near the pollen wall; L.The pollen grains at the stage of mitosis,the left one at the stage of metaphase,the right one has completed mitosis and resulted into a small lenticular generative cell and a large vegetative cell; M.The generative cell moved into the cytoplasm of the vegetative cell,a pore is clear; N.The 2-celled mature pollen grain with the pore unclear; O.Mature pollen grain in water slice showing three pore(arrows point to); P. SEM(Scanning electron micrograph) of mature pollen grain,the polar plate and equatorial plate can’t be distinguished and the pore can’t be observed; Q.Magnification of SEM of mature pollen grain showing detail of the extine ornamentation

3.2琼榄属与心翼果属小孢子发生和雄配子体发育特征比较

因其它各属缺少资料，在广义心翼果科内，我们仅将琼榄属和心翼果属进行比较。琼榄属和心翼果属的小孢子发生和雄配子体发育特征基本一致，但也稍有不同。两个属的相同特征有：花药四孢囊、花药壁四层、药室内壁具纤维性加厚、绒毡层为分泌型、小孢子母细胞胞质分裂同时型、小孢子四分体多为四面体型排列、成熟花粉粒为二细胞型。不同特征有：(1)琼榄属的绒毡层细胞为2～4核，心翼果属的为2核；(2)散粉时，琼榄的花药壁表皮仅留残迹，心翼果的花药表皮宿存，细胞结构完整；(3)琼榄属的花粉粒具隐藏的萌发孔，而心翼果属的花粉粒具明显的三孔沟[14,16]。

琼榄属和心翼果属的小孢子发生和雄配子体发育特征虽然比较一致，但在大孢子发生和雌配子体发育方面差异明显[14]，而且两属的这些共同特征在其它被子植物中也较为普遍，因而不能仅凭这些特征判定两个属的亲缘关系近。要想更好地理解琼榄属与心翼果属的亲缘关系，验证将琼榄属放入心翼果科是否合适还需要补充更多的广义形态学资料。要想验证心翼果科的扩大是否成立，还需要将其它各属胚胎学、孢粉学等广义形态学资料补充完整。

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Startup Fundation for Doctors of Ludong University(LY2015014)

introduction：KONG Dong-Rui(1975—),female,lecturer,mainly interested in plant systematics and plant reproduction.

date:2016-10-31

Microsporogenesis,MaleGametogenesisandPollenMorphologyofGonocaryumlobbianum

KONG Dong-Rui1LI Lu2

(1.School of Life Science,Ludong University,Yantai 264025；2.Yunnan Academy of Biodiversity,Southwest Forestry University,Kunming 650224)

We studied the microsporogenesis, male gametogenesis and pollen morphology ofGonocaryumlobbianumusing light microscopy and scanning electron microscopy to enrich the embryological and palynological data of Cardiopteridaceae s.l. The main results are as follows: (1)The anther is tetrasporangiate; (2)The anther wall comprises the epidermis, fibrous endothecium, ephemeral middle layer and secretory tapetum with 2-4 nuclei in each cell; (3)The microspore mother cell undergo meiosis, cytokinesis is simultaneous and the tetrads are tetrahedral; (4)The mature pollen grains are two-celled; (5)The pollen grains are cryptoaperturate with three pores and the extin is reticulate. The characters of microsporogenesis and male gametogenesis ofGonocaryumare similar to those ofCardiopteriswith a little difference.G.lobbianumis almost the same as the other species in the pollen morphological characters.

Gonocaryumlobbianum;microsporogenesis;male gametogenesis;pollen morphology;Cardiopteridaceae s.l.

鲁东大学博士启动基金(LY2015014)

孔冬瑞(1975—)，女，讲师，主要从事植物系统学和植物生殖生物学研究。

2016-10-31

S667.5

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.02.004