大豆低聚肽对UVB诱导的光老化小鼠皮肤中Ⅰ型和Ⅲ型胶原的影响

马立文 ，尹智 ，周炳荣 ，骆丹

（1．南京大学医学院附属鼓楼医院，南京210008；2．南京医科大学第一附属医院，南京210029）

大豆低聚肽对UVB诱导的光老化小鼠皮肤中Ⅰ型和Ⅲ型胶原的影响

马立文1，尹智2，周炳荣2，骆丹2

（1．南京大学医学院附属鼓楼医院，南京210008；2．南京医科大学第一附属医院，南京210029）

目的观察大豆低聚肽（SOP）对中波紫外线（UVB）诱导的BALB/c光老化小鼠皮肤中的Ⅰ型和Ⅲ型胶原的作用。方法BALB/c小鼠背部皮肤剃毛后予UVB照射，构建小鼠皮肤光老化模型。随机分组行UVB照射后分别外用不同浓度的SOP。组织切片、Masson染色观察胶原纤维改变并测定其胶原含量；实时荧光定量PCR（RT－PCR）检测MMP1、MMP3、COL1a1、COL3a1 mRNA。结果与对照组比较各浓度SOP组的胶原含量及COL1a1、COL3a1 mRNA表达增加（P＜0．05），MMP1、MMP3 mRNA 的表达减少（P＜0．05），且 SOP 中浓度组效果最显著（P＜0．05）。结论SOP 能有效对抗UVB所致BALB/c光老化小鼠皮肤中的Ⅰ型和Ⅲ型胶原的降解，对小鼠皮肤具有光保护作用。

大豆低聚肽；中波紫外线；Ⅰ型胶原；Ⅲ型胶原；基质金属蛋白酶－1；基质金属蛋白酶－3

中波紫外线是皮肤光老化的最主要的因素[1]，胶原纤维是人体皮肤中最主要的结构蛋白，UVB长期照射可以减少胶原纤维的合成，诱导基质金属蛋白酶（Matrix mtalloproteinases，MMPs）降解真皮层胶原纤维[2]。使用UVB反复照射可诱导出动物皮肤光老化[3]。大豆低聚肽（Soybean oligopeptide，SOP）是大豆蛋白经过蛋白质水解酶水解等处理后得到的300～700 kDa的范围内蛋白质水解产物，其有降压、降脂、抗氧化等多方面的功效。本研究观察了UVB所致慢性光损伤中小鼠皮肤中Ⅰ型和Ⅲ型胶原及MMP1、MMP3的影响及外用SOP对此影响的保护作用。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂 UVB辐射仪（美国Spectronic公司，并以配套的探测仪测定UVB剂量）、Leica采集图像信号系统（德国Leica公司）、实时荧光定量PCR试剂盒均购自南京凯基生物科技发展有限公司，引物由南京金斯瑞科技有限公司合成。大豆低聚肽冻干粉由无限极（中国）有限公司提供。

1.2 大豆低聚肽溶液配制 将大豆低聚肽冻干粉溶解于蒸馏水中，配成低浓度（2．5 IU/mL）、中浓度（5 IU/mL）、高浓度（10 IU/mL）、更高浓度（20 IU/mL）大豆低聚肽溶液，现配现用。

1.3 实验动物分组 南京医科大学实验动物中心购雌性BALB/c小鼠35只，月龄3周，体质量18～22 g。小鼠随机分为7组，每组5只，为UVB照射组（A）、空白对照组（B）、UVB+基质组（C）、UVB+SOP 低浓度组（D）、UVB+SOP中浓度组（E）、UVB+SOP高浓度组（F）、UVB+SOP更高浓度组（G）。

1.4 照光及用药 将所有小鼠在实验前1 d用松香石蜡拔毛法除去小鼠背部毛发，范围为2 cm×3 cm，A组及C-G组小鼠按如下方案[4]行UVB照射：照射5次/周，总计 8周；第 1～2周：60 mJ/cm2剂量照射；第3周：120 mJ/cm2剂量照射；第4周：180 mJ/cm2剂量照射；第5～8周：240 mJ/cm2剂量照射；照射总剂量6.9 J/cm2，UVB照射仪距小鼠约15 cm处。C组小鼠照光后于剃毛区皮肤1次/d，外用基质溶液1mL，D-G组小鼠照光后于脱毛区皮肤1次/d，分别外用相应不同浓度的SOP溶液1 mL，涂后以保鲜膜覆盖给药区1 h。

1.5 组织取材 照光结束后用断颈法处死小鼠，立即取下背部脱毛区全层皮肤，将皮肤分为2部分，一部分以10%福尔马林溶液固定，制作病理组织切片；另一部分皮肤去除皮下脂肪，在冰冻的生理盐水中漂洗，冷冻于-80℃冰箱以制备组织匀浆。

1.6 Masson染色 组织于10%福尔马林溶液中固定12 h后，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋切片，进行Masson染色。每只小鼠皮肤Masson染色标本随机选择5个视野，以Image-Pro Plus 6.0图像分析软件（Media Cybernetics公司开发）计算出染成蓝色的胶原纤维的光密度值，取其均值，用此种半定量的方法代表胶原纤维含量[5]。

1.7 Real-TimePCR法检测MMP1、MMP3和COL1a1、COL3a1基因的表达 冻存状态下，取小鼠皮肤组织研磨至粉末状，加入1 mL TRIzol试剂裂解细胞提取总RNA，纯化后逆转录为cDNA，稀释10倍后按20 μL反应体系扩增，引物序列由Primer5.0软件设计，见表1。95℃预变性5 min，随后95℃变性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸40 s，40个循环，72℃充分延伸10 min。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，根据循环（2-△△Ct）值计算MMP1、MMP3、COL1a1和COL3a1 mRNA的相对表达量。

1.6 统计学处理 所有数据均用SPSS 13.0软件进行处理，各组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外用SOP对光老化小鼠皮肤真皮胶原的影响B组胶原纤维深染、排列致密、分布均匀；A、C-G组胶原纤维则不同程度淡染，排列稀疏，见图1。与B组比较，所有组光密度值均不同程度减小（P<0.05），即胶原纤维含量不同程度减少；与A组比较，E-G组光密度值均不同程度增加（P<0.05），且E组最明显（P<0.05），说明E组胶原纤维降解程度最轻，见表2。

2.3 外用SOP对光老化小鼠皮肤中MMP1、MMP3、COL1a1、COL3a1 mRNA的影响 UVB照射组与空白对照组比较，MMP1和MMP3的基因表达有明显增高，而COL1a1、COL3a1 mRNA则出现明显下降，差异有统计学意义（P<0.05），UVB+各浓度SOP组分别与UVB照射组比较，MMP1、MMP3 mRNA有不同程度降低，COL1a1和COL3a1 mRNA则不同程度升高，且UVB+中浓度SOP组变化最明显（P<0.05），UVB各浓度SOP组的MMP1、MMP3、COL1a1、COL3a1 mRNA表达和UVB+中浓度SOP组间比较差异有统计学意义（P<0.05），见表 2。

表1 MMP1、MMP3、collagenⅠ和collagenⅢ基因和内参照物的引物序列

图1 各组小鼠真皮胶原的表达 （Masson染色×100）

表2 各组光密度值及相关基因水平比较 （±s）

表2 各组光密度值及相关基因水平比较 （±s）

注：avs.A 组，P<0.05；bvs.B 组，P<0.05；cvs.E 组，P<0.05。

组别 光密度值 MMP1 mRNA CoL1a1 mRNA MMP3 mRNA CoL1a3 mRNA A 0.145±0.013 1.001 6±0.066 4 1.0064±0.1391 1.0037±0.1079 1.001 6±0.069 3 B 0.456±0.020a 0.088 7±0.092 2a 14.2772±0.9890a 0.0657±0.0068a 16.400 2±1.136 0a C 0.136±0.022bc 0.977 7±0.039 6bc 1.235 6±0.128 4bc 1.051 2±0.112 9bc 1.177 4±0.081 5bc D 0.184±0.006bc 0.724 8±0.050 2abc 2.899 1±0.200 8abc 0.741 7±0.051 4abc 3.415 5±0.367 0abc E 0.361±0.020ab 0.308 2±0.021 3ab 7.154 1±0.768 7ab 0.501 8±0.052 2ab 8.587 9±0.594 9ab F 0.314±0.012abc 0.416 2±0.028 8abc 6.066 0±0.239 8abc 0.338 1±0.023 4abc 7.491 8±0.779 0abc G 0.277±0.038abc 0.479 1±0.049 8abc 5.298 0±0.569 3abc 0.379 5±0.029 5abc 5.933 9±0.411 0abc F 62.179 194.386 216.235 89.861 233.782 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

3 讨论

光老化中所表现出的皮肤皱纹、弹性下降、皮肤松弛等都是由真皮结构的改变所致，经研究发现，这些外在表现主要与真皮胶原含量减少有关[6]。其中最主要的是Ⅰ型和Ⅲ型胶原。Ⅰ型胶原约占皮肤胶原干重的85%，在真皮中聚集成与皮面平行的粗大纤维束，相互交织成网，是维持皮肤张力和承受拉力的重要成分，也是维持皮肤饱满充盈的物质基础。Ⅲ型胶原是构成网状纤维的主要成分，在维持皮肤弹性方面起重要作用。UVB长期照射可以减少胶原纤维的合成，本研究中UVB照射组小鼠皮肤胶原纤维淡染，排列稀疏，与空白对照组比较光密度值明显减小（P<0.05），外用不同浓度SOP组光密度值较UVB照射组不同程度增加（P<0.05），即胶原纤维含量不同程度增加。UVB照射组COL1a1、COL3a1 mRNA表达量较空白对照组明显下降（P<0.05），外用SOP后这种变化则有不同程度改善，且以中浓度SOP组较UVB照射组改善最为明显（P<0.05）。光密度值的变化与COL1a1、COL3a1 mRNA表达趋势一致。说明UVB长期照射导致小鼠皮肤中胶原纤维含量降低，且COL1a1、COL3a1 mRNA表达也明显下降，外用SOP可对抗UVB照射导致的胶原纤维的降解。

UVB长期照射可以诱导MMPs降解真皮层胶原纤维。MMPs是一大类具有其特定结构的锌依赖性内源性蛋白酶家族，可以降解细胞外基质蛋白，其中MMP1、MMP3的作用最重要。MMP1能水解Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维，这两种胶原纤维被MMP1切断后，MMP3可以继续降解断裂的胶原纤维，并且MMP3还能激活其他的基质金属蛋白酶，从而降解真皮中的胶原纤维等多种细胞外基质，使皮肤在紫外线损伤后胶原修复能力下降导致正常皮肤结构发生改变[7]。UV照射可以改变多种不同基因的表达，已证实其可以增加其中MMP1和MMP3的含量[8]。本研究中UVB照射组MMP1、MMP3 mRNA的表达与空白对照组比较明显增加，不同浓度外用SOP组中MMP1、MMP3 mRNA的表达则较UVB照射组不同程度下降，且以中浓度SOP组的MMP1、MMP3 mRNA表达下降最为明显（P＜0．05）。说明外用SOP可缓解UVB照射所致MMP1、MMP3 mRNA的表达增加，从而减少UVB对胶原纤维的降解。

SOP是大豆蛋白水解产物，其氨基酸组成几乎与大豆蛋白质完全一样，其有降压、降脂、抗氧化等多方面的功效。本实验小组前期实验发现外用SOP对UVB所致小鼠皮肤中的氧化损伤具有保护作用[9]，本实验进一步研究发现，外用SOP对UVB所致小鼠皮肤慢性光损伤中胶原纤维的降解具有保护作用，其机制可能是通过减少UVB所致MMP1和MMP3的含量的升高起作用。本实验对光老化的防治及SOP抗衰老产品的研制具有一定指导作用。

[1]Butler PE,Gonzalez S,Randolph MA,et al．Quantitative and qualitative effects of chemical peeling on photo－aged skin:an experimental study[J]．Plast Reconstr Surg,2001,107:222－228．

[2]Sárdy M．Role of Matrix metalloproteinases in skin ageing[J]．Connect Tissue Res,2009,50:132．

[3]Haarmann－Stemmann T,Boege F,Krutmann J．Adaptive and maladaptive responses in skin:mild heat exposure protects against UVB－induced photoaging in mice[J]．J Invest Dermatol,2013,133:868－871．

[4]Cho JM,Lee YH,Baek RM,et al．Effect of platelet－rich plasma on ultraviolet b－induced skin wrinkles in nude mice[J]．J Plast Reconstr Aesthet Surg,2011,64:e31－39．

[5]Kwon OS,Jung SH,Yang BS．Topical administration of manuka oil prevents UV－B irradiation－induced cutaneous photoaging in mice[J]．Evid Based Complement Alternat Med,2013,2013:930 857．

[6]Helfrich Y,Sachs DJ．Overview of skin aging and photoaging[J]．Dermatology Nursing,2008,20:177．

[7]Wang XY,Bi ZG．UVB－irradiated human keratinocytes and interleukin－1alpha indirectly increase MAP kinase/AP－1 activation and MMP－1 production in UVA－irradiated dermal fibroblasts[J]．Chin Med J（Engl）,2006,119:827－831．

[8]Cho HS,Lee MH,Lee JW,et al．Anti－wrinkling effects of the mixture of vitamin C,vitamin E,pycnogenol and evening primrose oil,and molecular mechanisms on hairless mouse skin caused by chronic ultraviolet B irradiation[J]．Photodermatol Photoimmunol Photomed,2007,23:155－162．

[9]马立文,赵宏伟,周炳荣,等．大豆低聚肽对中波紫外线诱导的光老化小鼠皮肤的保护作用[J]．中国皮肤性病学杂志,2014,28（2）:119－122．

Effects of Soybean Oligopeptide on Collagen TypeⅠandⅢin Mice Skin Irradiated by UVB

Ma Liwen1,Yin Zhi2,Zhou Bingrong2,Luo Dan2
1.Drum Tower Hospital,The Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School,Nanjing 210008,China;2.First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China

ObjectiveIn order to study the effects of soybean oligopeptide （SOP）on Collagen typeⅠandⅢ in BALB/c mice skin irradiated by ultraviolet radiation B（UVB）．MethodsBALB/c mice irradiated by UVB for a long time on back hair shaving．Each group smeared different concentration of SOP after UVB irradiation．Masson staining was used to observe the collagen changes and measure collagen content．Real time－PCR to determine the mRNA expression levels of MMP1,MMP3,collagen typesⅠandⅢ．ResultsThe collagen typeⅠandⅢ conten of used SOP groups showed higher than the group irradiated by UVB only（P＜0．05）．And the expression of MMP1,MMP3 mRNA also decreased（P＜0．05）．The middle dose SOP group had the most significant effect （P＜0．05）．ConclusionSOP can prevent the degradation of collagen typeⅠand Ⅲ in BALB/c mice skin irradiated by UVB light．

Soybean oligopeptide;Ultraviolet radiation B;Collagen typeⅠ;Collagen typeⅢ;MMP1,MMP3

R334．+5

A

1672－0709（2017）05－0395－04

骆丹，E－mail：daniluo2005@163．com

2017－04－14）