郁金银屑片对Balb/c裸鼠银屑病模型的实验研究

陈少秀，余静，冯萍，秦本露，杜晓

[湖北省十堰市太和医院（湖北医药学院附属医院），十堰442000]

郁金银屑片对Balb/c裸鼠银屑病模型的实验研究

陈少秀，余静，冯萍，秦本露，杜晓

[湖北省十堰市太和医院（湖北医药学院附属医院），十堰442000]

目的观察郁金银屑片对Balb/c裸鼠银屑病模型皮损组织中角质细胞生长因子（Keratinocyte growth factor,KGF）和双调蛋白（Amphiregulin，AREG）及两者基因表达的影响。方法将36只Balb/c裸鼠随机分为空白对照组、模型组和郁金银屑组，除空白对照组外，另2组裸鼠均用10%普萘洛尔涂于背部皮肤，2次/d，连续1周的方法造银屑病模型。成模后郁金银屑组按0.25 g/kg剂量灌郁金银屑片混悬液治疗2周，空白对照组和模型组灌等量生理盐水。对裸鼠背部皮损进行银屑病皮损面积及严重程度指数（PASI）评分；以酶联免疫吸附法（ELISA）定量检测皮损组织均浆液KGF和AREG的蛋白量，实时定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测KGF mRNA和AREG mRNA的表达。结果模型组和郁金银屑组造模后PASI评分、匀浆液中KGF和AREG明显升高，KGF mRNA和AREG mRNA高表达，与空白对照组比较，P＜0.05。在治疗2周后，模型组与同组治疗前比较，P＞0.05；郁金银屑组PASI评分、匀浆液中KGF和AREG降低，KGF mRNA和AREG mRNA低表达，与同组治疗前和模型组治疗后比较，P＜0.05，差异有统计学意义。结论郁金银屑片治疗银屑病机制与降低表皮组织匀浆液中KGF和AREG、下调两者基因表达密切相关。

郁金银屑片；银屑病模型；角质形成细胞生长因子；双调蛋白

郁金银屑片为临床常用治疗银屑病的中药制剂，为研究其作用机制，本研究采用Balb/c裸鼠银屑病模型，观察郁金银屑片对其皮损组织KGF、AREG表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 Balb/c品系裸鼠36只，体质量21～24 g，随机分为空白对照组、模型组和郁金银屑组，每组12只，动物实验在湖北医药学院动物中心实验室完成，实验室许可证为SYXK（鄂）2011－0031。

1.2 药品及试剂 郁金银屑片（陕西香菊药业集团有限公司，规格：0．24 g/片，批号：20151020914）；普萘洛尔片（江苏常州亚邦制药有限公司，批号：A20161223）；AREG和KGF的ELISA试剂盒（上海高创化学科技有限公司，批号：CSB－E04497，cyt－041）。

1.3 动物造模和治疗 按文献造模[1]，造模时先将普萘洛尔研碎并配成10%混悬液，然后用棉签均匀涂于模型组和郁金银屑组裸鼠背部皮肤，涂抹的厚度以1 mm、直径1 cm为宜，连续涂抹1周，2次/d[4]。成模判断标准：第8天观察裸鼠背部涂药处皮肤，以皮肤出现鳞屑、脱屑、红斑，病理检查有淋巴细胞浸润、乳头瘤样增生、棘层肥厚、角化过度或局灶性角化不良等银屑病样病变[2]。由于本实验选用的Balb/c无免疫力，对普萘洛尔高度敏感，故成功率达100%。治疗方法：治疗前先将郁金银屑片研碎、称重，然后用生理盐水将其配制成10%的混悬液。郁金银屑组按0．25 g/kg的剂量灌胃，2次/d，灌胃治疗2周，空白对照组、模型组按10 mL/kg灌生理盐水对照，疗程同前。

1.4 皮损组织KGF和AREG的ELISA定量检测3组裸鼠在治疗前和治疗2周时，每组各取6只处死，取背部皮损处皮肤（厚1 mm、直径1 cm），编号后放在－30℃低温冰箱保存，用于AREG和KGF蛋白检测。检测时，分别取出标本，研磨，匀浆，然后3 000转离心10 min，取匀浆液上清液，按试剂盒说明书进行操作，采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定匀浆液中AREG和KGF蛋白含量[3]。

1.5 组织 KGF和 AREG实时定量 RT－PCR分析 按文献[4]，将以上方法提取的匀浆液上清液取100 μL，对各组标本进行总RNA提取，采用反转录－聚合酶链反应（Reverse transcription polymerase chain reaction,RT－PCR） 逆转录酶合成 cDNA，用Trizol试剂（Invitrogen公司）提取表皮组织总RNA，用紫外分光光度计定量，测定KGF mRNA和AREG mRNA表达。KGF、AREG及内参引物序列见表1，通过标准曲线确定样本含量，KGF和AREG表达水平均经相应的基因拷贝数校正后，以相对值表示。

表1 引物序列表

1.6 统计学方法 统计分析软件使用SPSS 19．0，以±s表示实验数据，组间均数检验采用多因素方差分析，两两比较采用t检验，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗前后裸鼠皮损观察 造模前3组裸鼠表皮正常，模型组和郁金银屑组在治疗前，背部表皮均出现出现鳞屑、脱屑、红斑，病理检查有淋巴细胞浸润、乳头瘤样增生、棘层肥厚、角化过度或局灶性角化不良等银屑病样病变，说明用普萘洛尔造模可行。在治疗2周，空白对照组由于没用普萘洛尔造模，故治疗前后表皮正常，无银屑病样病变。模型组有4只裸鼠表皮病变加重，有严重的脱屑；郁金银屑组表皮钉突完全消退，表皮无角化、鳞屑、脱屑、红斑现象。

2.2 郁金银屑片对裸鼠AREG、KGF含量和银屑病皮损面积及严重程度指数（PASI）评分的影响 空白对照组裸鼠AREG、KGF含量和PASI评分治疗前后无明显变化；经2周治疗，模型组裸鼠AREG、KGF含量保持不变，PASI评分较高，与空白对照组比较，P＜0．05，同组治疗前比较，P＞0．05；郁金银屑组治疗2周后AREG、KGF含量和PASI评分明显降低，与模型组和同组治疗比较，P＜0．05，差异有统计学意义，见表2。

2.3 郁金银屑片对裸鼠AREG mRNA和KGF mRNA表达的影响 如表3，空白对照组裸鼠AREG mRNA和KGF mRNA表达治疗前后无明显变化；经2周治疗，模型组裸鼠AREG mRNA和KGF mRNA高表达，与空白对照组比较，P＜0.05；郁金银屑组治疗2周后AREG mRNA和KGF mRNA低表达，与模型组和同组治疗比较，P＜0.05差异有统计学意义。

表2 裸鼠AREG、KGF含量和PASI评分比较（±s）

表2 裸鼠AREG、KGF含量和PASI评分比较（±s）

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；与模型对照组比较，bP＜0.05；与同组治疗前比较，cP＜0.05。

组别空白对照组模型组郁金银屑组n 6 6 6 6 6 6时间 KGF（pg/mL） AREG（ng/mL） PASI治疗前 19.20±2.17 37.03± 5.59 2.87±0.45治疗第 2 周 21.11±2.42 35.79± 2.24 3.02±0.27治疗前 79.02±5.56a 104.74± 7.16a 5.97±0.41a治疗第 2 周 81.43±7.15a 107.48± 9.37a 6.11±0.52a治疗前 78.66±8.01a 106.29±10.25a 5.78±0.34a治疗第 2 周 19.15±2.18bc 40.35± 6.01bc 3.13±0.29bc

表3 裸鼠AREG mRNA和KGF mRNA表达比较 （±s）

表3 裸鼠AREG mRNA和KGF mRNA表达比较 （±s）

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；与模型对照组比较 ，bP＜0.05；与同组治疗前比较，cP＜0.05。

组别 AREG mRNA KGF mRNA空白对照组 21.32±1.87 17.56±0.89 20.28±1.50 18.14±1.02模型组 52.90±6.01a 45.42±3.71a 55.02±7.01a 43.24±2.95a郁金银屑组 55.94±5.42a 46.13±5.02a 23.25±3.12bc 19.71±0.92bc n 6 6 6时间治疗前治疗第2周治疗前治疗第2周治疗前治疗第2周

3 讨论

研究表明，表皮发育基因KGF在皮肤表皮细胞的发育过程具有促进表皮细胞分化的作用，同时，其对抑制上皮细胞的有丝分裂和维持表皮功能具有重要作用[5]。KGF保持相对稳定，但在银屑病皮损组织中，KGF会出现过度分泌现象而导致表皮过度角化或角化不全[6]。AREG分子C端有与表皮生长因子（Epidermal growth factor,EGF）相似的穿膜糖蛋白结构，该蛋白具有促进表皮细胞生长的作为，这种细胞生长因子可刺激成纤维细胞和肿瘤细胞的增殖[7-8]。AREG可在正常上皮细胞中表达，但保持在较低水平，而在银屑病皮损组织中会异常的高表达[9]。

本研究观察了BALB/c银屑病模型裸鼠在使用郁金银屑片治疗后皮损的情况，对裸鼠背部皮损情况进行了PASI评分，并检测了AREG和KGF蛋白及两者基因表达。观察发现，郁金银屑组裸鼠在经2周治疗后，皮损消失，无角化、红斑、鳞屑、乳头瘤样增生现象，表皮钉突完全消退，PASI评分到空白对照组水平。ELISA法定量检测显示裸鼠皮肤组织AREG和KGF蛋白明显降低，实时定量RT-PCR分析显示AREG mRNA和KGF mRNA低表达。

本实验通过对银屑病裸鼠模型皮肤组织ELISA法定量检测AREG和KGF蛋白，并通过实时定量RT-PCR分析AREG mRNA和KGF mRNA的表达。在实验中，模型组和郁金银屑组在治疗前，背部表皮均出现出现鳞屑、脱屑、红斑，病理检查有淋巴细胞浸润、乳头瘤样增生、棘层肥厚、角化过度或局灶性角化不良等银屑病样病变，说明用普萘洛尔造模可行，完全模拟了银屑病的病理改变。在治疗2周后，空白对照组由于没用普萘洛尔造模，故治疗前后表皮正常，无银屑病样病变。模型组和郁金银屑组在治疗前，AREG和KGF蛋白、AREG mRNA和KGF mRNA在皮肤组织存在明显的异常升高现象，而在治疗2周后，郁金银屑组这些指标明显降低，此结果提示郁金银屑片抑制AREG、KGF表达可能是治疗银屑病的机制之一。

中医在治疗银屑病以凉血养阴为主，兼顾活血解毒为辅，郁金银屑片就是基于这一理论和治疗原则研制而成。郁金银屑片由郁金、红花、秦艽、莪术、玄明粉、土鳖虫、皂角刺、雄黄、石菖蒲、关黄柏等多味中草药组成，具有清热解毒、疏通气血、凉血养阴、软坚消积、燥湿杀虫之功效[10-12]。中药从病机入手，通过辨证分型，治疗当以清热解毒、凉血散瘀、祛风止痒、养血润肤为主[13-15]。郁金银屑片就是基于这一理论研制而成，吸收后可使表皮细胞AREG、KGF蛋白合成降低，AREG mRNA和KGF mRNA低表达，这有利于细胞正常角化，使KGF介导的表皮细胞过度角化或角化不全现象减轻，且表皮组织的血管新生处于正常水平，从而达到治疗银屑病的目的。

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Experimental Study of Yujin Yinxie Pill on Balb/c Nude Mice Models of Psoriasis

Chen Shaoxiu,Yu Jing,Feng Ping,Qin Benlu,Du Xiao
Shiyan Taihe Hospital in Hubei Province（Affiliated Hospital of Hubei Medical College）,Shiyan 442000,China

ObjectiveIn order to observe the effects of Yujin yinxie pill on keratinocyte growth factor（KGF）and amphiregulin（AREG） in the Balb/c nude mice models of psoriasis as well as the expression levels of the two genes.MethodsAll of 36 Balb/c mice were randomly divided into control group,model group and Yujin Yinxie group,and the two treatment groups were coated on the back skin with 10%propranolol two times a day for one week to build psoriasis models.One of the model groups was treated with Yujin Yinxie pill in dose of 0.25 g/kg for two weeks;another two groups were given normal saline.Psoriasis area and severity index（PASI） score of the nude mice skin were analyzed.The protein expression level of KGF and AREG were detected in skin lesions by enzyme-linked immuno sorbent assay（ELISA）,and the mRNA expression of two genes were detected by real time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction（RT-PCR）method.ResultsCompared with the blank control group,the PASI score and the expression level of KGF and AREG increased significantly in the two model groups （P<0.05）.After treatment for two weeks,the saline model group （P>0.05）;but in the Yujin Yinxie pill group，PASI score and the expression level of KGF and AREG were lower than other groups（P<0.05）.The difference was statistically significant.ConclusionThe mechanism of Yujin Yinxie pill for psoriasis is closely related with reduction of gene expression of KGF and AREG.

Yujin Yinxie pill;Psoriasis models;Keratinocyte growth factor;Amphiregulin

R758.63

A

1672－0709（2017）05-0402－04

十堰市太和医院院级项目（2016JJXM041）

杜晓，E-mail:csxchensaoxuo@163.com

2016-10-06）