脂肪源性间充质干细胞移植治疗糖尿病大鼠勃起功能障碍的研究

李煜罡，王俞，潘恩山，陈锡钧，朱晓光

（南方医科大学中西医结合医院，广东 广州510315）

脂肪源性间充质干细胞移植治疗糖尿病大鼠勃起功能障碍的研究

李煜罡，王俞，潘恩山，陈锡钧，朱晓光

（南方医科大学中西医结合医院，广东 广州510315）

目的探讨脂肪源性间充质干细胞 （AD－MSCs）移植到糖尿病 （DM）勃起功能障碍 （ED）大鼠后，改善相关勃起功能的可能机制。方法制备、分离、培养AD－MSCs，研究其体内、外特性。新生雄性大鼠腹腔注射5－乙炔基－2－脱氧尿苷以跟踪内源性MSCs，8周后随机选择8只大鼠作为正常对照组 （N组），其余大鼠以剂量60 mg／kg链脲佐菌素 （STZ）行腹腔注射诱导DM，DM大鼠模型中随机选择8只作为糖尿病组 （DM组），另8只DM大鼠经AD－MSC治疗 （DM＋MSCs组）。所有大鼠通过检测阴茎海绵体内压 （ICP／MAP）等评估大鼠勃起功能，随后，取阴茎组织行组织学检查。结果AD－MSCs在体内、外可分化为肌细胞和内皮细胞。AD－MSCs移植后，DM大鼠阴茎海绵体内压 （ICP／MAP）值显著改善 （P＜0．05），阴茎组织中nNOS表达明显提高。结论AD－MSCs可治疗糖尿病ED，其可能机制是通过提高阴茎海绵体nNOS阳性神经、内皮细胞的表达，这可能也与介导内源性MSCs聚集有关。

脂肪源性间充质干细胞 （AD-MSCs）；糖尿病 （DM）；勃起功能障碍 （ED）；一氧化氮合酶 （nNOS）

糖尿病 （DM）是勃起功能障碍 （ED）发生的主要危险因素［1］，其中部分糖尿病ED患者对磷酸二酯酶－5抑制剂反应不佳［2］，目前干细胞治疗ED是研究的策略之一［3］，脂肪源性间充质干细胞 （AD-MSCs）因取材方便，具有自我更新能力［4］，同时保持其多向分化潜能，被认为是治疗糖尿病ED的有效方法。本实验从脂肪组织中分离间充质干细胞检测其生物学特性，并研究其对糖尿病ED模型大鼠的治疗作用。

1 材料与方法

1．1 实验动物

本研究中的所有动物实验均获动物保护及使用委员会批准。怀孕的Sprague－Dawley大鼠购自查尔斯河实验室 （Wilmington，MA），新生雄性大鼠用于本研究。为跟踪内源性MSCs，每只大鼠出生后立即腹腔注射5－乙炔基－2－脱氧尿苷（50 mg／kg， Invitrogen， Carlsbad， CA）［5］， 在 8 周龄时， 随机选择8只大鼠作为正常对照组 （N组）。其余大鼠均腹腔注射 60 mg／kg STZ （Sigma－Aldrich， St．Louis， MO）， 每周取鼠尾静脉血进行血糖监测 （Roche Diagnostics，Indianapolis，IN），血糖≥200 mg／dL，大鼠被认定为糖尿病并进一步实验，选取16只DM大鼠随机分为糖尿病组 （DM组）和阴茎海绵体内注射间充质干细胞治疗组 （DM＋MSCs），每组8只。

1．2 脂肪源性间充质干细胞的制备

初始脂肪是通过负压抽脂术从获得知情并同意捐助者处采集，并经过首都医科大学北京世纪坛医院伦理委员会批准后执行。初始抽吸脂肪用D－Hanks液洗涤去除广泛污染的血细胞和局部麻醉药。洗涤细胞2次再置入密度为2×106／mL的T－75组织培养瓶中， 在含有 57%DMEM／F－12、 40%MCDB－201、2%胎牛血清、10 ng／mL表皮生长因子、10 ng／mL血小板衍生生长因子BB，100 U／mL青霉素、100 lg／mL链霉素扩张。当贴壁细胞70%以上汇合，用0．125%胰蛋白酶和0．01%EDTA分离，并种植在1∶3稀释的相同培养条件下。

1．3 荧光激活细胞分选 （FACS）

为进行免疫表型分析，扩增脂源性干细胞，以抗Flk1、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD106抗体染色。细胞内抗原的检测，4℃下细胞被固定在2%多聚甲醛15 min，然后室温下在0．1%皂苷渗透1 h。细胞洗涤以异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗鼠二抗，山羊抗兔、羊antigoat抗体 （Sigma），然后洗净，用FACSCalibur流式细胞仪分析。

1．4 免疫印迹分析

SDS－PAGE可鉴定修饰酶谱，凝胶在缺乏明胶的情况下聚合在PAG（Serva，Heidelberg，Germany）网格装置，使用MMP－9通过 microsep超滤设备 （Pall Filtron，Dreireich，Germany）检测3次。样品 （40 mL）与加样缓冲液混合，然后在还原条件DL－DTT沸腾下分离或在非还原条件不沸腾情况下分离。电泳后，用半干印迹装置 （Pharmacia）把蛋白质转移到聚氟乙烯膜（Pall Filtron），用鼠单克隆抗体探针加入s－ICAM－1（0．4 mg／mL） 或 MMP－9 （0．2 mg／mL）， 并用过氧化物酶标记的二抗（Amersham，Braunschweig，Germany）孵育。按制造商的说明采用化学发光系统 （Amersham）检测。

1．5 RT－PCR

核糖核酸的分离和反向转录与先前研究一致。寡核苷酸引物序列如下：β肌动蛋白 （264 bp）， 正向：5－GAGAC CTTCAACAC CCCAGCC －3； 反 向 ： 5 －AATGTCACGCAC GATTTCCC－3； s－ICAM－1 （264 bp）， 正向： 5－CTGGCGGAG CACAACGAACT －3， 反 向 ： 5 －AGGATATCTCCATTGGGCT GAAAG－3； MMP－9 （201 bp）， 正向： 5－TCCCCATCGCCATCC CC－3， 反向： 5－CACCATGGCCTCGGCTGG－3。 所有上述基因，在相同的循环条件（94℃、1 min，57℃、50 s，72℃、1 min）下进行扩增，特定基因 （s－ICAM－1、MMP－9）除外。

1．6 流式细胞仪检测

离心收集细胞，PBS洗涤，弃含杂物上清液，在－20℃以70%酒精固定保存过夜，再用磷酸洗 3次。用 0．5 mg／mL RNase A 溶解 30 min， 再以 65 μg／mL PI染色 1 h。 用 FACS流式细胞分析仪 （BD Biosciences）分析。以给定的阳性细胞百分比值和荧光相对强度作为表达水平的标准。

1．7 统计学处理

采用SPSS 13．3统计软件处理，按多样本均数比较的方差分析处理数据，运用LSD法进行多重比较。由于mRNA相对表达量各组间方差不齐 （P＝0．025），采用Welch近似方差分析，运用Tambane＇s T2法进行多重比较。

2 结果

2．1 AD－MSCs细胞形态和表面标志物

来源于脂肪组织的MSCs是梭形纤维状的。CD11a、CD31、CD34、 CD45、 CD184、 Flk－1和 HLA－DR 均为阴性， 而 CD29、CD44、CD73、CD105、CD166和表面标志 HLA－ABC均为阳性。见图1。

图1 hAD－MSCs的生物学特性

2．2 AD－MSCs移植提高糖尿病大鼠的勃起功能

与N组比较，DM组大鼠勃起功能严重受损，阴茎海绵体内压 （ICP／MAP）值显著降低，AD－MSC治疗后，以三种不同电流峰值 （0．5 mA、 1．0 mA、 1．5 mA） 刺激阴茎神经， DM ＋MSCs 组的 ICP／MAP 值显著改善（P ＜0．05）， 在 1．0 mA 和 1．5 mA时接近正常对照组，见图2。

2．3 AD－MSCs可促进神经再生

免疫组化检测大鼠阴茎组织中有nNOS表达，组织学图像显示染成红色、绿色、蓝色分别代表nNOS阳性神经纤维，平滑肌和细胞核，见图3。为清晰起见，组织学图像分为背神经（图A~C）、背动脉 （图D~F）和海绵体血窦 （图G~I）。 箭头指向代表nNOS阳性点，DM＋MSCs组在这三个部位nNOS表达的定量数据与DM组比较均有统计学差异 （P＜0．05）。

图2 N组、DM组、DM＋MSCs组的ICP／MAP值

图3 N组、DM组、DM＋MSCs组nNOS的表达

3 讨论

近十年ED的研究有巨大进步［6］，但DM合并ED治疗仍较困难。现提出一种干细胞疗法治疗策略，且在某些领域已进行了一些临床和临床前试验［7］。AD-MSCs移植治疗糖尿病ED尚未在临床前研究。因此，本研究以STZ诱导建立糖尿病ED大鼠模型，并用AD-MSCs移植治疗，探索其作用机理。

STZ诱导的DM大鼠伴有勃起功能差［8］，引起大鼠阴茎nNOS阳性神经受损［9］且明显减少［10］。本研究发现AD-MSCs移植能显著改善STZ诱导的DM大鼠勃起功能且能显著提高nNOS阳性神经纤维表达，包括背神经、背动脉和海绵体血窦。这种nNOS阳性神经纤维高表达是AD-MSCs移植治疗糖尿病ED的潜在机制。糖尿病ED患者和DM动物模型阴茎海绵体组织中均出现血管内皮损伤和内皮功能障碍［11］，这已得到一致确认。本研究发现AD-MSCs移植能显著恢复上述两种组织内皮细胞的数量。因此，内皮的保护或再生是AD-MSCs移植治疗糖尿病ED的另一种可能机制。

综上所述，STZ诱导的糖尿病ED与阴茎勃起相关组织细胞减少有关 （神经、血管内皮细胞、平滑肌），AD-MSCs移植能够显著恢复这些组织细胞功能。此外，AD-MSCs有益的作用是否与介导内源性MSCs聚集有关尚待进一步研究。

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Study on Adpose-Derived Mesenchymal Stem Cells Transplantation in the Treatment of Erectile Dysfunction in Diabetic Rats

LI Yugang,WANG Yu,PAN Enshan,CHEN Xijun,ZHU Xiaoguang
(TCM-Integrated Hospital of Southern Medical University,Guangzhou 510315,China)

ObjectiveTo explore the possible mechanism of adipose-derived mesenchymal stem cells(AD-MSCs)transplantation to improve the relative erectile function of rats with diabetes mellitus(DM)associated erectile dysfunction(ED).MethodsAD-MSCs were prepared,separated and developed to study their characteristics in vivo and in vitro.Newborn male rats were intraperitoneally injected with 5-ethynyl-2-deoxyuridine for tracking endogenous MSCs.8 weeks later,eight of these rats were randomly selected as the normal control group(N group).The remaining rats were injected intraperitoneally with 60 mg/kg of streptozotocin(STZ)to induce DM.Eight of these DM rats were randomly selected as the DM group,while another eight rats were treated with AD-MSC(DM+MSCs group).All rats'erectile function were evaluated by intracavernous pressure(ICP/MAP)detection.Afterward,their penile tissues were collected for histological examination.ResultsAD-MSCs could differentiate into muscle cells and endothelial cells in vivo and in vitro.After AD-MSCs transplantation,the ICP/MAP of DM rats significantly improved(P＜0.05).The nNOS expression in penile tissues significantly increased.ConclusionsAD-MSC can be used in the treatment of erectile function in rats with DM associated ED.The possible mechanism is to improve the expression of nNOS-positive nerves and endothelium in cavernosa,and may be related to mediate the recruitment of endogenous MSCs.

Adipose-derived mesenchymal stem cells(AD-MSCs);Diabetes mellitus(DM);Erectile dysfunction(ED);nNOS

R587.2；R698

A

10.3969/j.issn.1674-4659.2017.11.1528

2017－06－19

2017-08-17

广东省科技计划项目 （项目编号：20140211）；南方医科大学中西医结合医院院长基金 （项目编号：1201401001）

李煜罡 （1973－），男，陕西西安人，副主任医师，从事泌尿外科及男科学的临床、教学及科研工作。

（责任编辑：常海庆）