几种药剂及烟草提取物对草莓灰霉病的药效分析

□颜旭 文勇 韩庆新 李兰/成都市农林科学院

几种药剂及烟草提取物对草莓灰霉病的药效分析

□颜旭 文勇 韩庆新 李兰
/成都市农林科学院

草莓外观多呈心形，果实色泽艳、营养高、风味浓、结果早、效益好，具有较高的营养价值和经济价值，同时也是现代农业生产的十大支柱产业之一，备受生产者和消费者的青睐，素有“果中皇后”的美誉。随着我国草莓种植面积的不断增加，其种植过程中发生病害的问题日益突显，其中由灰葡萄孢菌引起的草莓灰霉病是目前草莓生产中的重要病害之一，一般会导致草莓减产10%～30%，重者达50%以上。

烟草在我国种植面积大，可用于吸食，含有丰富的蛋白质、柠檬酸和苹果酸等。目前，废弃烟叶大量堆积，因此对烟草的多用途研究很有必要。烟草提取物中的新植二烯和植醇是良好的致香前体物质；烟碱有杀虫和杀菌作用，是良好的生物杀菌剂。生物杀菌剂是指利用生物活体或其代谢产物针对农业有害生物进行杀灭或抑制的制剂。生物杀菌剂既不污染环境、毒害人畜、伤害天敌，又不会诱发抗药性，是目前大力推广的高效、低毒、低残留的“无公害”农药。

本实验通过水蒸气蒸馏的方法对废弃烟叶进行蒸馏提取，用烟草馏出物以及市面上常用的几种防治灰霉病的药剂作用于草莓灰霉病菌，采用菌丝生长速率法，测定几种杀菌剂和烟草提取物对草莓灰霉病的敏感性，分析多种杀菌剂及烟草提取物对草莓灰霉病菌的抑菌效果，以此为防治草莓灰霉病提供新的药剂，为科学合理地使用杀菌剂提供依据，同时为烟草废物利用拓宽方向。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 草莓灰霉病病果、病花

2017年3～4月，收集四川省成都市农林科学院种植大棚里染灰霉病的草莓花和果实，用于提取草莓灰霉病菌，并经成都市农林科学院草莓研究实验组和四川农业大学病理实验室鉴定为草莓灰霉病菌。

1.1.2 废弃烟叶材料

2015生产的废弃烤烟烟叶（由四川农业大学特用植物栽培系实验室提供）。

1.1.3 供试试剂和药剂

试剂：NaOH、葡萄糖、琼脂、链霉。

药剂：扑海因（500 g/L异菌脲）拜耳作物科学（中国）有限公司，怪客（500 g/L异菌脲）江苏辉丰农化股份有限公司，健达（吡唑醚菌酯21.2%，氟唑菌酰胺21.2%）德国巴斯夫，靚贝（400 g/L嘧霉胺）永农生物科学有限公司，科灰2号（0.3%丁子香酚）河南博爱惠丰生化农药有限公司，瑞镇（50%嘧菌环胺）瑞士先正达。

1.2 方法

1.2.1 马铃薯蔗糖培养基（PDA）的制作

马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂20 g，水1 000 mL。马铃薯切成小块状放入锅中煮沸，之后用4层纱布过滤，再加入蔗糖和琼脂，搅拌均匀后用蒸馏水定容到1 000 mL，再放入高压灭菌锅中灭菌，灭菌后再在37℃温箱培养24 h，无菌生长的培养基方可使用。

1.2.2 草莓灰霉病菌的分离纯化

用灭菌的木质牙签轻触采集的染病病果、病花上的灰霉病菌霉层，并将其迅速放入马铃薯蔗糖培养基（PDA）平板上带回实验室。在25℃恒温保湿培养1～2 d，促使其产孢。一个病果（病花）作为一个菌株，用PDA培养基培养。取分离好的菌落经形态结构分析及显微镜观察证实为灰葡萄孢，挑取菌落边缘菌丝于灭完菌的PDA培养基上培养，重复以上步骤3～4次。鉴定标准是：顶端膨大呈头状，顶端有小突起，突起地方密生小柄并着生大量分生孢子，形似葡萄穗，有隔膜，丛生、单枝或树状分枝。

1.2.3 烟叶提取物制备方法

将废弃烟叶置于65℃烘箱中干燥30 min，测定其含水率为10%时用打粉机将其磨成烟末，将烟末混合均匀后取20 g加入三角瓶中，再加入少许NaOH调节pH值至碱性，然后加入200 mL水，并用水蒸气蒸馏法蒸馏烟样，收取馏出物200 mL，并定容到250 mL。在4℃冰箱中保存备用。

1.2.4 试验设计

1.2.4.1 烟草提取物施用量药效试验

以烟草提取物施用量作为试验因素，制成含有0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL烟叶提取物的20 mL PDA平板培养基，形成4个处理；以不加烟草提取物的PDA平板培养基为CK。操作如下：将灭菌后的PDA培养基熔化，冷却到50℃左右，用移液枪分别移取2.5 mL、5.0 mL、10.0 mL、20.0 mL烟叶提取物于100 mL灭完菌的干燥锥形瓶中，加入0.3%的链霉素抑制细菌，再用分别不同体积的PDA培养基使总体积达100 mL，并振荡摇匀后等份倒入5个培养皿中。

1.2.4.2 不同药剂药效试验

先用电子天平称取瑞镇（50%嘧菌环胺）0.1 g于灭完菌的容量管中，再用移液枪移取10 mL无菌水，摇匀震荡后配制成0.01 g/mL的溶液；取0.01 g/mL的溶液5 mL于100 mL灭完菌的干燥锥形瓶中，然后加入PDA培养基使溶液总体积达100 mL，并振荡摇匀后等份倒入5个培养皿中，使最终PDA培养基中瑞镇浓度为0.5 g/L。用同样方法配置各种药剂，浓度分别为：扑海因0.5 g/L、健达0.26 g/L、靚贝0.47 g/L、科灰2号0.67 g/L、怪客0.5 g/L，最后制成含药PDA培养基平板。

1.2.5 接种及培养方法

用打孔器（Ф=5 mm）在培养好的菌落外缘打孔制备菌饼，将菌饼菌丝一面朝下，接种到培养基中央，以向培养皿内加入20 mL的空白PDA培养基做对照组。每处理3次重复，置于25℃黑暗培养箱中培养。

1.2.6 考查指标及方法

每24 h用十字交叉法测量菌落直径，取平均值，计算菌丝生长抑制率。

抑菌率=（对照菌落生长直径-处理菌落生长直径）/（对照菌落生长直径-霉菌菌块初始直径）×100%

1.2.7 数据处理

试验数据用DPS7.05数据处理软件进行统计分析（取5%显著水平）。

2 结果与分析

2.1 烟草提取物抑制效果分析

为了更加全面地分析出烟草提取物对灰霉病菌的作用效果，在经过4 d对照组 （CK） 菌 丝长满PDA培养基平 板 （ Ф=8.5 mm）后，仍继续观测处理组菌丝生长情况，烟草提取物处理下菌落直径、抑制效果见表1、2。

通过对表1和表2的分析可得，不同体积相同观察时间处理下，含有4.0 mL烟草提取物的培养基抑制效果最明显，2 d观察时间下，4.0 mL处理和1.0 mL处理、0.5 mL处理差异显著，抑菌率分别相差11%、10%；1.0 mL处理和2.0 mL处理间差异显著，相差7.6%，其余处理间差异不显著；3、4、5 d观察时间下，均只有4.0 mL处理和0.5 mL处理差异显著，抑菌率分别相差7.6%、8.4%、4.4%，其他处理间不显著；6 d观察时间下，各处理间差异都显著。说明高浓度的烟草提取物对草莓灰霉病菌有抑制作用，且随着观察时间延迟，效果越显著。

烟草提取物不同观察时间的抑制率见图1。从图1可以看出，同种体积不同观察时间处理下，随着观察时间的延迟，抑制效果减弱，这可能和烟草提取物中含有的烟碱、新植二烯、植醇等有关。随着病原菌的呼吸作用，烟碱可以作为病原菌的养分被吸收，产生各种代谢产物，从而抑制病菌的生长；新植二烯、植醇均有抑制真菌生长的效果，但二者是致香前体物质，随着时间延迟，其在培养基中有效成分挥发，从而抑制效果减弱。

2.2 药剂抑制效果分析

药剂对灰霉病菌的抑制效果见表3。从表3分析可得，不同药剂在2 d观察时间处理下，抑制效果最好的是科灰2号处理，抑制率高达97.5%，同扑海因、怪客处理差异显著，抑菌率相差1.1%、3.9%，和其余处理差异不显著；抑制效果最差的是靚贝，靚贝属于嘧霉胺类杀菌剂，杀菌机理是抑制病菌蛋氨酸的生物合成和细胞壁降解酶的分泌，但处理效果差的原因可能是所选材料植株上的灰霉病菌对靚贝这种杀菌剂已经产生了抗药性，所以药效比其他药差，仅和瑞镇处理有差异，相差达20%以上，和其余处理没有差异；瑞镇处理同其余各处理间均存在差异，这应该和菌落长势有关，菌落长势起初是平铺生长，后面便是纵向生长，在很大程度上干扰了实验数据测量。

表1 烟草提取物处理下灰霉病菌的菌落直径

图1 烟草提取物不同观察时间抑制率

表2 烟草提取物对灰霉病菌的抑制效果

3 d观察时间以后，抑制效果最好的都是扑海因，分别为94.5%、91.5%、86.7%，最差的依然为靚贝处理，抑制效果为68.3%、64.5%、53.5%；在4 d（对照组长满培养基平板）后，各处理间的差异显著增多，且处理效果大多保持在70%以上。说明这些药剂的药效是好，但同时残留也高，对环境和人体健康存在隐患。

各药剂处理下不同时间灰霉病菌生长直径见图2。从图2可知，相同药剂不同观察时间处理下，各药剂处理均表现出随观察时间延迟药剂处理对灰霉病菌的抑制效果减弱，其中靚贝的减弱效果最大。灰霉病菌具有繁殖速率高、遗传变异大、适合度高的特性，若连续使用同一种杀菌剂，灰霉病菌很容易产生抗药性。病原菌无时无刻不在生长繁殖，但是药剂添加就只有1次，所以，时间越久，病原菌产生的各种代谢产物同药剂有效物质发生作用越多，药效稀释是可以预见的，这也是在生产实践中要多次施药的原因。

3 结论与讨论

3.1 结论

不同体积的烟草提取物对草莓灰霉病菌有一定抑制效果，并且随着施用体积分数的增加抑制效果越明显，其中4.0 mL处理效果最好，达56.26%，相比其他处理显著。药剂处理实验中，在短期时间内，科灰2号处理效果最佳；3 d过后，扑海因处理抑制效果最好，靚贝处理抑制效果一直最差；同种药剂都随着观察时间延迟抑制效果减弱，但是减弱效果没有烟草提取物明显。

表3 药剂对灰霉病菌的抑制效果

图2 各药剂处理下不同时间灰霉病菌生长直径

3.2 讨论

分析表2和表3可以得出，烟草提取物的抑制效果和药剂相比还有一定差距，烟草提取物效果最好的4.0 mL也比药剂效果最差的靚贝弱；烟草提取物和药剂处理对草莓灰霉病菌的抑制效果都随观察时间的推移而减弱，其中烟草提取物的减弱程度高于药剂。但是，不一定哪种药抑制效果越好就用哪种药，还要兼顾经济阀值等因素，烟草提取物具有无毒、无残留、绿色环保等优点，且获取和制作手段相对简单，对比农药还是有一定优势。如果提取物再经过一定的加工手段，防治效果可能会更好，并且现在灰霉病菌对市面上的大多数杀菌剂有不同程度的抗性，因此，使用烟草提取物与药剂防治相结合的方式，可以有效减缓抗性菌株的形成，为研究新型杀菌剂提供时间。

在药剂处理实验中发现，经瑞镇处理过的菌落特征有别于其他处理，主要表现在菌落长势较短时间里是平铺生长，但后面是纵向生长，取菌丝时在显微镜下观察不能找到孢子，菌丝有隔膜。瑞镇有效成分嘧菌环胺杀菌机理独特，主要是通过抑制蛋氨酸的生物合成，并抑制水解酶的分泌以达到抑菌防病目的。该药物在病菌孢子萌发后起作用，通过抑制病菌菌丝体生长和穿透，从而降低了孢子萌发。

扑海因处理抑制效果最好，除了所采植株抗药性低的原因外，还与扑海因有效成分异菌脲的作用机理有关。异菌脲属于二羧酰亚胺类杀菌剂，通过抑制细胞色素C还原酶破坏类脂类和膜的合成而发生效果。

烟草提取物中成份有很多，但是最主要的还是烟碱。烟碱能麻痹昆虫的神经系统，从而达到有效防治害虫的作用。还有研究表明，灰霉病菌的最佳生长pH值是5.0，说明该菌在偏酸性环境下生长，而烟碱呈碱性，这可能是烟草提取物能抑制病原菌的原因之一，虽然效果没有农药明显，但烟碱来源于烟叶，绿色无污染，符合绿色健康的理念，废弃烟叶库存量大，材料易获得，是用于生物防治的不二选择。