Class I/II新城疫弱毒株诱导SPF鸡免疫损伤及黏膜免疫应答的比较分析

戴建华，孟春春，高 崧，丁 铲

（1.扬州大学兽医学院，扬州 225403；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；3.江苏农牧科技职业学院，泰州 225300）

Class I/II新城疫弱毒株诱导SPF鸡免疫损伤及黏膜免疫应答的比较分析

戴建华1,2,3，孟春春2，高 崧1，丁 铲2

（1.扬州大学兽医学院，扬州 225403；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；3.江苏农牧科技职业学院，泰州 225300）

为了比较Class I新城疫弱毒JS10株和Class II新城疫弱毒La Sota株免疫雏鸡后的免疫损伤和黏膜应答情况。本研究将60只SPF白来航鸡，随机分成A、B、C 3组。7日龄时，A组和B组分别用JS10株和La Sota株进行滴鼻、点眼免疫，C组以同样方式接种PBS，并于免疫后的d1、4、7、14，每组随机抽取5只扑杀，分别收集唾液、气管、肺和肠的冲洗液，使用双夹心ELISA试剂盒测定SIg A、Ig M 和Ig Y的抗体水平。结果显示，2株病毒均未产生免疫损伤；JS10株产生的黏膜抗体水平均高于La Sota株，并且免疫后的d7、14的唾液、气管和肠冲洗液中的SIg A的抗体水平以及肺中Ig Y抗体水平均显著高于La Sota（p＜0.05）。研究表明，2株新城疫弱毒滴鼻、点眼后都能诱导消化道和呼吸道产生强烈的黏膜免疫反应，并且与免疫后的日龄存在明显相关性。由于JS10株可诱导更好的黏膜免疫应答，提示其可作为新型新城疫弱毒疫苗的候选株。

Class I/II新城疫弱毒；免疫损伤；黏膜免疫；抗体水平

黏膜免疫应答是指动物机体与外界直接或间接相通的腔道（呼吸道、消化道、泌尿生殖道等）黏膜表面的免疫反应，它是机体抵御感染的重要环节[1]。黏膜免疫系统（mucosal immune system，MIS）是由黏膜相关的淋巴组织构成的免疫系统，MIS主要是分布在泪道、唾液腺分泌管、呼吸道、胃肠道、乳腺、泌尿生殖道等黏膜内的淋巴组织[2,3]。黏膜免疫系统的表面有着十分重要的免疫组织结构与免疫功能，具有明显的体液和细胞免疫功能，局部抗原刺激即能有效地使黏膜分泌大量的分泌型免疫球蛋白A（SIg A），其可阻止病原微生物在黏膜上皮层定植和繁殖并限制它们进入上皮层[4,5]。

许多禽类传染性疾病的病原都可通过感染黏膜传播，如：新城疫、禽流感、传染性支气管炎等[6-8]。因此研制和开发能够充分调动黏膜免疫应答的疫苗，对提高抗感染效果将会有显著提升。有关新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）诱导的黏膜免疫反应目前的研究还知之甚少，仅局限于杨倩等[9]利用鸡新城疫病毒（NDV）弱毒疫苗免疫蛋鸡，通过免疫组织化学染色显示在肠黏膜相关淋巴样组织（gut associated lymphoid tissue，GALT）和呼吸道黏膜相关淋巴组织（respiratory tract associated lymphoid tissue，BALT）中均检测到SIg A细胞的生成及分布[9]。马金萍等[10]报道NDV 弱毒苗滴鼻、点眼后能够诱导消化道产生共同黏膜免疫反应，并且与日龄存在相关性[10]。由于新城疫弱毒疫苗存在价格低廉、使用方便等灭活疫苗不可比拟的优势，故仍在我国广泛使用[11-13]。但以上研究都未聚焦于黏膜免疫是否影响NDV弱毒疫苗的保护效果这一最为迫切解决的临床问题。本实验室前期在国内外首次报道了Class I新城疫弱毒的免疫原性优于Class II 新城疫弱毒，具体表现为能够克服遗传距离远的不利因素，对当前流行的Class II 强毒提供更有效的保护和减少免疫鸡群感染后的排毒[14]，但其具体机理并不清楚，本文选择比较Class I/II新城疫弱毒诱导SPF鸡黏膜损伤的情况和黏膜免疫应答水平作为研究方向，尝试从黏膜免疫角度来解释Class I新城疫弱毒免疫原性良好的确切机制，并为日后综合评价NDV弱毒疫苗提供新的参考方向。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF种蛋购自北京梅里亚维通有限公司。SPF鸡为本实验室将SPF种蛋自行孵化，出壳后置于隔离器中饲养，期间自由采食和饮水。

1.2 病毒与主要试剂

Class II新城疫弱毒La Sota株均为本实验室自行保存，9～11日龄SPF鸡胚尿囊腔接种进行复壮，并测定EID50，最终统一标定为106EID50/0.1 mL。鸡Ig Y、Ig M和Ig A 双夹心ELISA试剂盒均购自上海艾博抗有限公司。

1.3 实验设计

1.3.1 黏膜损伤测定 将JS10和La Sota均以106EID50的剂量分别通过滴鼻、点眼的方式感染2只1日龄SPF鸡。感染后72 h统一扑杀，采集肺、肠和脾用多聚甲醛固定24～48 h，经常规方法制备石蜡切片，经HE染色后光镜观察。

1.3.2 黏膜应答测定 选取60只SPF雏鸡，随机分为A、B、C共3组，每组20只。A组和B组分别于7日龄免疫JS10和 La Sota，免疫剂量均为106EID50，免疫方式为滴鼻、点眼。C组为对照组不接种病毒。各组均在免疫后的d1、4、7、14采集检测样品，每组抽取5只鸡，处死后采集各种黏膜洗脱液（包括唾液、气管冲洗液、肺冲洗液和回肠冲洗液），-20℃冻存。

1.4 黏膜免疫抗体的测定

操作。

1.5 数据统计与分析

采用SPSS19.0统计软件分析各试验组之间的差异性。

参照试剂盒说明书步骤

Class I新城疫弱毒JS10株和

2 结果

2.1 2株弱毒株在SPF鸡体内增殖比较

为了比较2株弱毒株在SPF鸡体内是否会引起损伤，我们用病理切片观察了2株病毒株感染后不同脏器的病理变化差异，见图1。结果显示，JS10株和La Sota株感染后与对照组相比其肺脏、肠道和脾脏均无眼观异常。结果显示，JS10是1株弱毒株，它不对鸡体产生免疫损伤，可作为疫苗候选株。

2.2 唾液中抗体水平测定

图1 NDV JS10株和La Sota株免疫的SPF鸡的主要器官病理切片Fig 1 Histopathology examination of NDV JS10 and La Sota Strain in vaccinated SPF

免疫新城疫弱毒苗后唾液中抗体变化水平，见图2。免疫后在d1，2个免疫组均检测不到抗体（SIg A、Ig M和Ig Y），与空白对照C组差异不显著（P＞0.05）。在免疫后d4，JS10和La Sota免疫组的抗体水平均有上升，与空白对照组相比差异具备显著统计学意义（P＜0.05）；抗体水平在免疫后d7比d4有明显升高（P＜0.05），但到d14时，抗体水平与d7相比变化不大。相同时间段（d7 和d14）比较，JS10免疫组的抗体水平均高于La Sota免疫组，其中SIg A抗体水平差异具备显著统计学意义（P＜0.05），但Ig M和Ig Y抗体水平差异不具备显著统计学意义（P＞0.05）。

2.3 气管冲洗液中抗体水平测定

免疫新城疫弱毒苗后气管冲洗液中，抗体变化水平，见图3。在气管冲洗液中，免疫后d1 2个免疫组均检测不到抗体（SIg A，Ig M和Ig Y），与空白对照C组差异不具备显著统计学意义（P＞0.05）。在免疫后d4，JS10和La Sota免疫组的SIg A和Ig M抗体水平显著上升，与空白对照组相比差异具备显著统计学意义（P＜0.05）；而抗体Ig Y水平则在免疫后d7才明显升高，但到d14时三组抗体水平与d7相比均变化不大。相同时间段（d4，d7和d14）比较，JS10免疫组的抗体水平均略高于La Sota免疫组，其中SIg A抗体水平差异具备显著统计学意义（P＜0.05），但Ig M和Ig Y抗体水平差异不具备显著统计学意义（P＞0.05）。

2.4 肺冲洗液中抗体水平测定

免疫新城疫弱毒苗后肺冲洗液中抗体变化水平，见图4。在肺冲洗液中，免疫后d1 2个免疫组均检测不到抗体（SIg A，Ig M和Ig Y），与空白对照组差异不具备显著统计学意义（P＞0.05）。在免疫后d4 JS10和La Sota免疫组的抗体水平均有上升，与空白对照组相比差异具备显著统计学意义（P＜0.05）。抗体水平在免疫后d7和d14比d4有明显升高（P＜0.05）；而d7与d14时抗体水平变化不大，但SIg A和Ig Y的抗体水平呈现出继续升高的趋势，Ig M的抗体水平则比d7有下降趋势。相同时间段（d7和d14）比较，JS10免疫组的抗体水平均高于La Sota免疫组，其中Ig Y抗体水平差异具备显著统计学意义（P＜0.05），但SIg A和Ig M抗体水平差异不具备显著统计学意义（P＞0.05）。2.5 肠冲洗液中抗体水平测定 免疫新城疫弱毒苗后肠冲洗液中抗体变化水平见图5。在肠冲洗液中，免疫后d1 2个免疫组均检测不到抗体（SIg A，Ig M和Ig Y），与空白对照C组差异不具备显著统计学意义（P＞0.05）。直到免疫后d7，JS10和La Sota免疫组的3种抗体水平才均有上升，与空白对照组相比差异具备显著统计学意义（P＜0.05）。三种抗体水平在免疫后d7和d14比d4有明显升高（P＜0.05）；而d7与d14时抗体水平变化不大。相同时间段（d7和d14）比较，JS10免疫组的抗体水平均高于La Sota免疫组，其中SIg A抗体水平差异具备显著统计学意义（P＜0.05），但Ig M和Ig Y抗体水平差异不具备显著统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

前期单独用La Sota疫苗株通过点眼途径免疫，来研究鸡哈氏腺中Ig A、Ig M、Ig Y型浆细胞的数量变化及分布特点，结果表明Ig A、Ig M、Ig Y型浆细胞的出现比对照组早，而且数量多，其中IgA型浆细胞数量最多[15-17]。马金萍[10]等人使用自行建立的间接ELISA方法，检测了La Sota活苗滴鼻、点眼免疫SPF鸡，并分别于免疫后不同时间采集消化道洗脱液和胆汁样品，测定SIg A、Ig M和Ig Y的抗体水平。结果表明NDV 弱毒苗滴鼻、点眼后能够诱导消化道产生共同黏膜免疫反应，并与免疫后的日龄存在相关性。本研究结果与以上报道类似，而且在消化道粘膜和呼吸道黏膜的洗脱液中都能检测到3种抗体滴度显著上升，近一步证实了NDV 弱毒疫苗可以诱导鸡体产生大量的黏膜抗体。

图2 鸡唾液中NDV特异性SIg A、Ig M 和Ig Y的变化Fig.2 The changes of NDV specific SIg A, Ig M and Ig Y levels in saliva of chicken at different stage

图3 鸡气管冲洗液中NDV特异性SIg A、Ig M 和Ig Y的变化Fig.3 The changes of NDV specific SIg A, Ig M and Ig Y levels in trachea of chicken at different stage

图4 鸡肺冲洗液中NDV特异性SIg A、Ig M 和Ig Y的变化Fig.4 The changes of NDV specific SIg A, Ig M and Ig Y levels in lung of chicken at different stage

图5 鸡肠冲洗液中NDV特异性SIg A、Ig M 和Ig Y水平的变化Fig.5 The changes of NDV specific SIg A, IgM and Ig Y levels in intestine of chicken at different stage

IgA 在黏膜免疫中起着重要的作用，Ig A 在黏膜表面以分泌型Ig A（SIg A）为主，它是消化道黏膜免疫的主要效应因子。目前，小肠中Ig A 分泌细胞数量的变化已成为评价小肠局部黏膜免疫力的标准之一。黏膜免疫抵抗病毒感染主要通过SIg A发挥作用的，其最大特点是将抗体的反应控制在感染的门户部位—黏膜局部，当病毒抗原入侵时，SIg A大量分泌并通过SIg A与进入黏膜表面的病毒结合，阻止病毒不与上皮细胞结合引起致病作用，这是作为机体对病毒感染第一道防御屏障，也是最容易清除病毒感染的部位[18-21]。本文研究结果表明，Class I弱毒JS10 株产生的黏膜抗体水平均高于La Sota株，并且在d7和d14的唾液、气管和肠冲洗液中SIg A的抗体水平以及肺液的Ig Y 抗体水平均显著高于La Sota（P＜0.05）。这一现象与之前发现JS10 可以显著降低免疫鸡群在NDV攻毒后的排毒量有较好的吻合性，暗示或许是由于该毒株可以诱导高水平的黏膜免疫能力，故在清除强毒感染时效率更高。

随着养禽业的不断发展，规模化、集约化程度不断提高，禽类的疾病防治问题也越来越突出，除了加强饲养管理，还应该合理使用疫苗。家禽通过疫苗诱导黏膜免疫反应，可以更加有效地防御病原微生物的入侵。因此，在预防一些经黏膜途径感染的病原微生物如禽流感病毒、新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒等传染病时应考虑到黏膜免疫的重要性。具体表现为在开发新型禽用疫苗的时候应考虑到选育最大限度激发动物机体黏膜免疫功能的毒株，若黏膜免疫功能被很好地激发则可以做到减少疫苗的使用剂量和更好地保护免疫动物，从而达到提高控制传染病的感染效率这一根本目标。

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ANALYSIS OF IMMUNE INJURY AND MUCOSAL RESPONSES INDUCED BY ATTENUATED CLASS I/II NEWCASTLE DISEASE VIRUSES

DAI Jian-hua1,2,3, MENG Chun-chun2, GAO Song1, DING Chan2
(1. College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225403, China; 2. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS,Shanghai 200241, China; 3 Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College, Taizhou 225300, China)

The objective of the present study was to investigate the immunological injury and mucosal response induced by attenuated Newcastle disease virus strains JS10（Class I）and La Sota (Class II). In this experiment, 60 SPF chicks were randomly divided into group A, B and C. At the age of 7 days, chicks in group A and B were respectively immunized with JS10 strain and La Sota strain and chicks in group C

PBS as controls. 5 chicks in each group were randomly terminated at d1, 4, 7 or 14 post immunization. Saliva,trachea, lung and intestinal samples were collected for detection of mucosal antibodies SIg A, Ig M and Ig Y using double sandwich ELISA kits. The results showed that these two NDV strains did not cause any immune injury. The JS10 strain induced higher levels of mucosal antibodies as compared with La Sota strain and significant differences (p＜0.05) were revealed at d 7 and d 14 post immunization.

Newcastle disease virus; immunological injury; mucosal response; antibody lever

2017-10-09

中央级公益性科研院所基本科研业务费项目（2017JB08）；中国农业科学院创新工程“水禽病毒病团队”项目

戴建华，男，博士研究生，预防兽医学专业

高崧，E-mail:gsong@yzu.edu.cn

S852.659.5

A

1674-6422（2017）06-0037-06