泛素-蛋白酶体系统参与新城疫病毒的早期复制

曲昱蓉，詹 媛，仇旭升，谭 磊，孙英杰，宋翠萍，孟春春，丁 铲

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

·研究论文·

泛素-蛋白酶体系统参与新城疫病毒的早期复制

曲昱蓉，詹 媛，仇旭升，谭 磊，孙英杰，宋翠萍，孟春春，丁 铲

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

为了研究泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，UPS）具体参与新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）复制的哪个阶段，本研究通过在NDV感染不同阶段加入泛素-蛋白酶体系统抑制剂MG-132，结合使用蛋白酶K试验证明泛素-蛋白酶体系统并未参与NDV入侵细胞的过程，而是参与了NDV入侵细胞之后的复制早期阶段（0～6 h）。再利用蔗糖密度梯度离心试验分离细胞内体，使用针对内体标志蛋白Rab5的抗体确定内体位于第8～10层。建立了检测Herts/33毒株P基因的绝对荧光定量方法，绘制了标准曲线。并通过该绝对荧光定量法比较MG-132和DMSO处理的细胞内体中病毒含量，发现使用抑制剂处理的细胞内体所在层中病毒含量较高，提示蛋白酶体抑制剂可以使NDV滞留于细胞内体中。本研究首次证明泛素-蛋白酶体系统参与了NDV进入细胞后从内体释放出来的过程。

泛素-蛋白酶体系统；新城疫病毒；MG-132；内体

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）是一种多边形的有囊膜的病毒，病毒粒子直径大约200～300 nm。其基因组为不分节段的单股负链RNA[1]。新城疫病毒是一种在经济上非常重要的禽类病毒，它可以导致家禽养殖业巨大的损失[2]。

泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，UPS）是真核细胞中除溶酶体系统外最重要的蛋白质降解系统。靶蛋白的泛素化过程一般为泛素活化酶E1通过自身活性位点的半胱氨酸残基与泛素分子的羧基末端进行共价结合以激活泛素分子。这种含有高能硫酯键的泛素分子通过E1的活性位点传递至下一级反应，即与泛素连接酶E2反应。最终泛素蛋白连接酶E3与结合在E2上的泛素分子和底物蛋白相结合，将泛素分子转移至底物蛋白上。最终26S蛋白酶体识别并降解已被K48位泛素化修饰的靶蛋白，完成蛋白质降解过程[3]。

相关研究表明冠状病毒属中的鼠肝炎病毒（Mouse hepatitis virus，MHV）在使用蛋白酶体抑制剂MG-132后，会被滞留于内体（Endosome），或被错误诱导至溶酶体（Lysosome）中，阻碍其进一步复制。证明泛素-蛋白酶体系统参与到MHV从内体释放到细胞质的过程中[4]。通过全基因组的RNA干扰筛选发现一种泛素蛋白连接酶（E3）-Itch蛋白，在Itch蛋白被敲除的细胞中，流感病毒的病毒核糖核蛋白复合体可以正常进入内体，但却无法从内体中释放出来，这也说明泛素-蛋白酶体系统参与流感病毒从内体释放出来的过程[5]。

之前的实验已经初步验证泛素-蛋白酶体系统参与到NDV在细胞中的复制[6]。但NDV在进入细胞后，是否也要利用泛素-蛋白酶体系统协助其在细胞内转移却不清楚。为了进一步探索泛素-蛋白酶体系统参与NDV复制的具体机制，我们首先利用蛋白酶体抑制剂MG-132确定了泛素-蛋白酶体系统参与NDV复制的早期阶段。在初步确定相关的时间阶段后，利用蛋白酶K试验，确定泛素-蛋白酶体不参与NDV入侵细胞的过程，而仅参与到入侵细胞后复制的早期阶段。最后我们利用蔗糖密度梯度离心法来分离细胞内体（Endosome），建立绝对荧光定量法检测Herts/33毒株P基因，证明当使用蛋白酶体抑制剂MG-132时，大量NDV会被滞留于内体中，证明NDV在复制早期阶段会利用泛素-蛋白酶体系统协助其在细胞内发生转移。

1 材料与方法

1.1 毒株与细胞

本试验所用病毒毒株为NDV标准强毒Herts/33毒株，由扬州大学刘秀梵院士惠赠；鸡胚成纤维细胞系DF-1细胞和人子宫颈癌细胞系HeLa细胞由本实验室保存，细胞采用含10%胎牛血清的DMEM培养液，常规37℃、5%CO2培养箱中传代培养。

1.2 蛋白酶体抑制剂阶段性加入实验

参考文献[4]方法，接种DF1细胞至35 mm培养皿中，待细胞生长至90%时，将培养皿分成6组，分别为a组（无MG-132处理）、b组（MG-132预处理2 h）、c组（MG-132全程处理）、d组（MG-132处理0～6 h）、e组（MG-132处理6～12 h）和f组（MG-132处理12-18 h）。按照该分组方式使用蛋白酶体抑制剂MG-132（10 μmol/mL），每组细胞都接种1 MOI Herts/33病毒。在病毒感染后6、12、18、24 h收取细胞上清，并再次换上1.5 mL新鲜培养基继续培养。检测每个时间点收取细胞上清TCID50值，结果按照Reed-Muench法计算。

1.3 泛素-蛋白酶体系统对NDV入侵过程的影响

1.3.1 蛋白酶K药物浓度筛选试验 将DF1细胞接种至35 mm培养皿中，待细胞生长至90%时，接种1 MOI Herts/33株病毒，置于4℃培养15 min，用PBS漂洗3次后将一个培养皿继续置于4℃培养，使NDV仅吸附在细胞上，另一个培养皿置于37℃培养15 min，使已经吸附在细胞膜上的NDV可以入侵细胞。将蛋白酶K进行系列稀释，分别稀释为0.1、0.2、0.25、0.5、1、2、2.5、5、7.5、10、15、20 μg/mL，作用细胞5 min后，用PBS漂洗3次以去除残留的蛋白酶体K。换上含有3%FBS的维持培养后，在细胞培养箱中继续培养12 h后收取细胞上清，检测其TCID50值。在这个试验中蛋白酶K被用于洗去吸附于细胞表面但未能入侵的病毒粒子。蛋白酶K是从林伯氏白色念球菌中纯化得到的一种高活性蛋白酶，可用于一般生物样品中蛋白质的降解，切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键[7]。

1.3.2 蛋白酶K药物试验 DF1细胞接种至35 mm培养皿中，待细胞生长至90%时，其中2个培养皿使用10 μmol/mL MG-132处理细胞2 h，另设2个相同稀释度DMSO处理细胞培养皿。抑制剂预处理2 h后接种1 MOI Herts/33株病毒，立即将细胞置于4℃冰箱孵育15 min，用PBS漂洗3次后，换上无抗无血培养基，将一个MG-132处理培养皿和一个DMSO处理培养皿继续置于4℃培养15 min，另一组的2个培养皿置于37℃培养15 min。用0.5 μg/mL蛋白酶K作用细胞5 min以去除吸附于细胞表面但未能入侵的病毒粒子，PBS漂洗3次以去除残留的蛋白酶K。换上维持培养基继续培养，12 h之后收取每个培养皿的上清并检测计算上清TCID50值。

1.3.3 肝素钠阳性对照试验 DF1细胞接种至35 mm培养皿中，待细胞生长至80～90%时，其中一个培养皿用100 μg/mL肝素钠预处理2 h，另一个培养皿使用10 μmol/mL MG-132预处理2 h，作为空白对照的培养皿中只加入无抗无血DMEM培养基。预处理2 h后，根据细胞计数结果，感染1 MOI Herts/33病毒后立即置于4℃培养15 min，用PBS清洗3次，换上新鲜培养基后都置于37℃培养15 min，0.5 μg/mL蛋白酶K 处理5 min后，用PBS漂洗3次以去除残留的蛋白酶体K。换上维持培养基继续培养，12 h之后收取每个培养皿的上清并检测计算TCID50值。文献报道肝素钠能阻断病毒入侵[8]，在本试验中作为影响病毒入侵的阳性对照药物。

1.4 蛋白酶体抑制剂对新城疫病毒入侵后影响

1.4.1 蔗糖密度梯度离心 将HeLa细胞接种至100 mm培养皿中，细胞生长至90%时，使用0.4 μmol/mL的MG-132预处理细胞2 h，接种1 MOI Herts/33株病毒，37℃细胞培养箱中作用1 h，再换上含有MG-132的维持培养基继续培养3 h。设置相同稀释度的DMSO处理组。将培养皿中培养基弃去，用PBS清洗3次后，置于冰上，使用Homogenization buffer（100 mL水，250 mmol/L 蔗糖，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF）裂解细胞，每个培养皿中加入500 μL Homogenization buffer，冰上裂解30 min后，收集裂解液通过22-G（6.5号）针头10次，4℃、1000×g的离心15 min，取上清即为PNS（已提取过核酸的上清）。轻轻滴加60%蔗糖溶液，将PNS中蔗糖浓度调整为40.6%。将2.4 mL上述蔗糖浓度为40.6%的PNS溶液置于13.8 mL超速离心管底层，在上面缓慢加入4.8 mL 35%蔗糖溶液，再上一层为1.5 mL 25%蔗糖溶液，最上一层为1 mL Homogenization buffer。另一个离心管中以同样方式加入DMSO处理的细胞样品，两个离心管配平后在超速离心机中以4℃、100 000×g离心1 h。离心结束后从上至下取出10层溶液置于离心管中，冻存于-80℃。

1.4.2 蔗糖密度梯度离心分层结果鉴定 从蔗糖密度梯度离心收取的各层溶液中取出80 μL溶液，加入5×SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液，混匀后沸水煮10 min，进行Western blot试验。使用的抗体为针对早期内体（Endosome）标志物的Anti-Rab5抗体和针对细胞质标志物的 Anti-actin抗体。

1.4.3 蔗糖密度梯度离心分层样品脱糖及cDNA样品制备 取实验1.4.1蔗糖密度梯度离心各层样品各500 μL置于无RNA酶的离心管中，在其中加入1 mL无水乙醇，混匀后置于-40℃过夜，4℃、12 000×g离心20 min。弃去上清并将离心管液体全部吸干，加入500μL DEPC水溶解即为脱糖样品，提取脱糖样品RNA，并反转录为cDNA。

1.4.4 绝对荧光定量标准曲线绘制 根据Herts/33病毒 P基因核苷酸序列，设计并合成1对特异性荧光定量PCR引物。Herts/33-F：5'-ATTTCAGGT CCCGGAGATCC-3'；Herts/33-R：5'-GAGGTG ATCAATGCACGGAC-3'。以Herts/33 P基因质粒作为标准品，根据其浓度和质粒片段长度计算拷贝数/μL。将该质粒进行稀释后作为荧光定量PCR反应的模板。将Herts/33病毒P基因质粒稀释成8个稀释度，作为模板进行Real-time PCR，其PCR反应程序：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环后，以DNA拷贝数的对数即log（DNA copies）为横坐标，以Ct值为纵坐标，绘制标准曲线图，并得出标准曲线方程。

1.4.5 Real-time PCR法检测蔗糖密度梯度离心各层样品 采用试验1.4.4中相同的Real-time PCR反应程序，对蔗糖密度梯度离心后各层样品cDNA进行Real-time PCR试验，多次检测后取Ct值的平均值，带入标准曲线方程以计算蔗糖密度梯度离心分离各层样品中Herts/33病毒P基因的表达情况。

2 结果

2.1 泛素-蛋白酶体参与到NDV增殖的早期阶段

我们通过将蛋白酶体抑制剂MG-132的分阶段加入结合细胞上清病毒滴度检测试验来确定泛素-蛋白酶体系统参与到NDV感染周期的关键性阶段，可以从图1看出当全程使用MG-132时，细胞上清的病毒滴度一直都较低。在0～6 h阶段，病毒处在早期增殖阶段，每个处理组的病毒滴度都较低，而从6 h开始病毒逐渐增殖，上清中病毒的滴度达到顶峰。在复制早期阶段（0～6 h）时，c处理组（全程处理）和d处理组（0～6 h处理）的上清病毒滴度最低，而b处理组（2 h预处理）对病毒滴度的抑制作用几乎没有。在病毒增殖的中期和晚期，除了c处理组（全程处理）的病毒滴度受到抑制，其余处理组的病毒滴度与未使用MG-132的空白组几乎一样。由此初步证明泛素-蛋白酶体系统参与NDV复制早期阶段。

图1 处理各个时间段细胞上清中的病毒滴度Fig.1 The virus titers of each time period in culture medium

2.2 蛋白酶K工作浓度确定

DF1细胞感染1 MOI病毒后，立即置于4℃让病毒吸附15 min后用PBS洗去未吸附的病毒，将一组细胞继续置于4℃，只吸附而没有或极少病毒可以入侵；另一组细胞转移至37℃培养箱，使已吸附的病毒粒子可以侵入细胞；最后两组细胞分别用12种不同浓度的蛋白酶K处理5 min，洗去未入侵的病毒，继续培养12 h后检测上清TCID50值。试验过程中发现当蛋白酶K浓度大于0.5 μg/mL时，处理5 min后细胞出现脱落现象，说明蛋白酶K浓度过大。而当浓度为0.25 μg/mL、0.2 μg/mL或0.1 μg/mL时，无论细胞是否有37℃的入侵阶段，病毒滴度都不发生改变，说明蛋白酶K的浓度过低，未能洗去未入侵的病毒。而当蛋白酶K浓度为0.5 μg/mL时，一直置于4℃培养的细胞上清病毒滴度比转移至37℃培养的细胞上清滴度要低100.56，说明0.5 μg/mL蛋白酶K处理5 min，可以洗去吸附于细胞膜表面的病毒。由此，最终确定蛋白酶K 的工作浓度为0.5 μg/mL。

2.3 泛素-蛋白酶体系统未参与NDV入侵

用10 μmol/mL的MG-132和相同稀释度的DMSO分别预处理细胞2 h后，感染1 MOI Herts/33病毒并先置于4℃使病毒吸附15 min，用PBS洗去细胞表面未吸附的病毒后，分为两组，一组继续置于4℃、15 min，另一组置于37℃入侵15 min。以0.5 μg/mL蛋白酶K作用5 min处理未入侵病毒后，用PBS漂洗3次，以去除残留的蛋白酶K，换上维持培养液继续培养12 h后，检测细胞上清TCID50。结果显示，当将细胞一直置于4℃时，MG-132处理组病毒滴度为103.67/0.1 mL，DMSO组的病毒滴度为103.72/0.1 mL；当细胞先置于4℃，后置于37℃，使病毒入侵时，MG-132处理组病毒滴度为104.1/0.1 mL，DMSO组的滴度为103.96/0.1 mL。以上结果暗示，无论病毒入侵细胞的阶段存在与否，蛋白酶体抑制剂MG-132对NDV的入侵没有影响（图2）。

图2 蛋白酶体抑制剂MG-132对病毒入侵的影响Fig.2 Effect of proteasome inhibitor MG-132 on NDV internalization

以相同的试验方法，使用MG-132和肝素钠这2个药物，肝素钠可以阻断病毒粒子吸附细胞作为阳性对照药物，空白细胞组的TCID50为104.25/0.1 mL，MG-132处理组的病毒滴度为104.25/0.1 mL，而肝素钠处理组的病毒滴度为103.8/0.1 mL。发现使用蛋白酶体抑制剂MG-132对病毒入侵无影响，而使用肝素钠的细胞，因阻止病毒吸附进而影响入侵细胞的病毒粒子数，最终导致细胞上清中病毒滴度降低。由此，进一步证实泛素-蛋白酶体系统参与NDV感染的早期阶段，虽然不参与入侵阶段，但是参与NDV入侵细胞之后的早期复制阶段（图3）。

图3 蛋白酶体抑制剂MG-132和肝素钠对病毒入侵的影响Fig.3 Effect of proteasome inhibitor MG-132 and Heparin on virus internalization

2.4 蔗糖密度梯度离心后分层结果

我们用MG-132和DMSO分别作用于HeLa细胞，预处理2 h后，感染1 MOI Herts/33病毒后，继续用MG-132和DMSO处理细胞3 h。处理细胞后进行蔗糖密度梯度离心，离心结束后从上至下逐层取出1～-10层。使用针对早期内体标志物的抗体anti-Rab5进行Western blot试验，结果表明，该蔗糖密度梯度离心法将内体主要分离至8～-10层（图4）。

图4 蔗糖密度梯度离心分层鉴定Fig.4 Identification of the samples of sucrose density gradient centrifugation

2.5 Real-time PCR标准曲线绘制

所制备的Herts/33病毒P基因标准品质粒浓度为378.8 ng/μL，质粒大小为1200 bp，换算成拷贝数为2.881×1014copies/μL。将该标准品质粒从5-5～5-12稀释成8个稀释度，取每个稀释度质粒2μL作为模板进行Real-time PCR，在多次试验确定最终反应条件之后，同时进行重复性试验。在这个稀释范围内，线性关系良好，以DNA拷贝数的对数为横坐标，以平均Ct值为纵坐标，绘制标准曲线图，并得出标准曲线方程Y=-3.3024X+47.4777，R2为0.9996（图5）。

图5 Herts/33病毒P基因质粒标准曲线Fig.5 Standard curve of Herts/33 P gene

2.6 蛋白酶体抑制剂对NDV入侵细胞后在细胞内分布的影响

我们将蔗糖密度梯度离心后各层样品提取RNA并反转录为cDNA，作为Real-time PCR反应的模板，检测使用蛋白酶体抑制剂MG-132和使用相同稀释度DMSO处理细胞中病毒分布情况的差异。将多次检测结果Ct值取平均值后带入标准曲线，计算每层样品中Herts/33病毒P基因的拷贝数。发现当使用蛋白酶体抑制剂MG-132后，第8、9、10层中病毒含量比不使用该抑制剂对照组中病毒含量高，且差异显著（图6），而根据Western blot实验结果显示，第8、9、10层为内体所在的层，我们推测当使用蛋白酶体抑制剂后，NDV有可能会被滞留于内体。

图6 蛋白酶体抑制剂MG-132导致NDV滞留于内体Fig.6 The proteasome inhibitor MG-132 retained the NDV in the endosomes

3 讨论

泛素-蛋白酶体系统中发挥降解蛋白质功能的26S蛋白酶体，由一个催化核心即20S蛋白酶体分子和位于两端的两个19S调节复合体组成。MG-132是一种肽醛类20S蛋白酶体活性抑制剂，它通过与20S蛋白酶体的β内环上活性位点的苏氨酸氨基端羟基形成共价半缩醛键而抑制其蛋白水解活性，是一种常用的泛素-蛋白酶体抑制剂[9]。已经有文献报道泛素-蛋白酶体参与到新城疫病毒的复制，但该系统参与到新城疫病毒复制的具体阶段却还不清楚，所以在本实验中，我们使用MG-132阶段性加入，结合NDV感染实验，来确定泛素-蛋白酶体系统参与到NDV感染的何种阶段，结果显示，泛素-蛋白酶体系统参与NDV感染早期阶段（0～6 h）。

为了进一步确定泛素-蛋白酶体系统是参与到NDV入侵细胞的阶段还是入侵之后的早期复制阶段，我们设计实验利用蛋白酶K处理吸附于细胞表面但还未入侵的病毒粒子。发现无论是否使用蛋白酶体抑制剂MG-132，NDV在只有吸附过程或同时具有37℃入侵阶段时，病毒的增殖都未受到MG-B2的影响，这就说明泛素-蛋白酶体系统并未参与NDV入侵细胞的过程。再结合上述MG-132阶段性加入的试验结果，我们得出一个初步的结论，泛素-蛋白酶体系统参与到NDV进入细胞后早期复制阶段。

早期内体一般是内吞途径中用于运输内吞物质的囊性小泡，将内吞物质从细胞膜表面运送至晚期内体和溶酶体之中[10]。副粘病毒属需要通过识别细胞上受体蛋白，继而病毒囊膜与细胞受体膜发生融合才能引起病毒感染。在膜融合的过程中，F蛋白在内体酸性环境中发生构象转变是至关重要的一步[11]。NDV通过内吞途径进入细胞后，泛素-蛋白酶体系统是否参与到NDV进入内体，并从内体释放的过程是我们关心的。

为了验证这一假设，我们采用蔗糖密度梯度离心的方法分离细胞内体，根据相关文献的报道，我们将细胞样品制备成含有40.6%的蔗糖溶液，置于离心管最底层，离心时内体逐渐上浮，达到特定蔗糖密度的所在层。Rab5、Rab7、Rab9和Rab11都是比较好的早期内体的标志物，在我们的试验中采用anti-Rab5抗体用于检测是否分离到内体，并确定内体分离至8、9、10这三层。我们先制备Herts/33株NDV P基因质粒标准品，以此标准品做模板绘制绝对荧光定量标准曲线。再根据Western blot实验结果，将蔗糖密度梯度离心样品进行脱糖，并提取总RNA。反转录为cDNA当做模板进行绝对荧光定量PCR试验。将各层样品中检测数值带入标准曲线，计算每层样品P基因表达拷贝数，结果显示在蔗糖密度梯度离心所分离的8、9、10层中，MG-132处理的细胞中NDV含量比DMSO处理的细胞要高。从这一试验的结果，我们推测，蛋白酶体抑制剂的加入很有可能将NDV滞留于内体中，阻止其从内体释放出来，进而阻止其基因组RNA的复制。总之，本研究初步证明泛素-蛋白酶体系统参与NDV入侵细胞后复制早期从内体释放出来的过程。

参考文献

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THE UBIQUITIN-PROTEASOME SYSTEM PARTICIPATES IN THE EARLY STAGE OF NEWCASTLE DISEASE VIRUS REPLICATION

QU Yu-rong, ZHAN Yuan, QIU Xu-sheng, TAN Lei, SUN Ying-jie, SONG Cui-ping, MENG Chun-chun,DING Chan
(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

The proteasome system inhibitor MG-132 together with the protease K were used to study the role of ubiquitin-proteasome system (UPS) in the specific replication stage of Newcastle disease virus (NDV) in host cells. The results showed that the ubiquitin-proteasome system did not participate in the NDV invasion stage but was involved in the early stage of replication (0-6 h) after the invasion of the cells. The intracellular endosomes were isolated at 8-10 layers using sucrose density gradient centrifugation assay and confirmed using antibodies against the endosome marker protein Rab5. The absolute fluorescence quantitative method for detecting the P gene of Herts / 33 strain was developed to detect the viruses in endosomes from MG-132 treated cells and DMSO treated cells. It concluded that the MG-132 treated cells had higher viral content in the endosomes, suggesting that ubiquitin-proteasome system inhibited NDV release from endosomes.

Ubiquitin-proteasome system; Newcastle disease virus; MG-132; endosome

2017-05-19

国家自然科学基金（31372421、31530074 ）；公益性行业（农业）科研专项（201303033）

曲昱蓉，女，博士研究生，预防兽医学专业

丁铲，E-mail：shoveldeen@shvri.ac.cn

S852.659.5

A

1674-6422（2017）06-0001-07