华南虎疑似感染猫细小病毒的PCR鉴定与病理组织学检查

黄翠琴，范克伟，余 佳，傅文源，林开雄，杨守深，林青青，杨小燕

（1.龙岩学院生命科学学院，龙岩 364012；2.福建省生猪疫病防控工程技术研究中心，龙岩 364012；3.福建农林大学动物科学学院，福州 350001；4.福建梅花山华南虎繁育研究所，龙岩 364201）

华南虎疑似感染猫细小病毒的PCR鉴定与病理组织学检查

黄翠琴1,2，范克伟1,2，余 佳1,3，傅文源3，林开雄3，杨守深1,2，林青青1，杨小燕1,2

（1.龙岩学院生命科学学院，龙岩 364012；2.福建省生猪疫病防控工程技术研究中心，龙岩 364012；3.福建农林大学动物科学学院，福州 350001；4.福建梅花山华南虎繁育研究所，龙岩 364201）

对1例疑似感染猫细小病毒的死亡华南虎幼虎进行病理剖检、病原PCR检测和病理组织切片观察。结果表明，死亡幼虎的肠道组织中能检测出猫细小病毒核酸；病理组织切片镜检结果显示，死亡幼虎胃、肠粘膜出血，大量粘膜上皮细胞坏死、脱落，严重部位粘膜层基本消失，并伴有大量炎性细胞浸润；心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑等组织也均有较为严重的病理损伤。以上结果提示，该死亡幼虎感染了猫细小病毒，且该病毒对幼虎多种主要器官造成了严重的损伤。

华南虎；猫细小病毒；PCR；病理组织学

随着我国濒危虎群繁殖保护工作的开展，虎只数量明显增加，但疫源疫病对野生动物的危害也在不断增大。近年来国内先后出现了禽流感和犬瘟热病毒对虎的跨种致死性感染，以及虎猫温热、猫鼻气管炎、猫鼻结膜炎、巴氏杆菌病、弓形虫病和锥虫病等疫病的发生，严重威胁到了虎的健康甚至种群保护[1-9]。华南虎亦称“中国虎”，国家一级保护珍稀濒危动物，是中国特有和历史最悠久的虎种。近年来我国不断有圈养华南虎感染疫病的报道[1,7,10]，表明疫病已成为我国濒危华南虎群繁殖保护工作的重要制约因素之一。

猫细小病毒（Feline parvovirus virus，FPV）又称为猫泛白细胞减少症病毒、猫瘟病毒和猫传染性肠炎病毒。在自然条件下除可感染猫科动物外，还可感染浣熊、水貂和狐狸等多种动物，其中以幼龄动物最为易感，感染动物在临床上主要呈现以高热、呕吐、肠炎和白细胞严重减少为特征的临床症状[4,8]。

福建梅花山华南虎繁育研究所发生1例疑似华南虎幼虎感染猫细小病毒急性死亡的病例，为进一步调查造成该幼虎急性死亡的原因，本文针对该病例进行了病理剖检、病原PCR检测和病理组织切片观察，并对其死亡原因进行了分析讨论，以期为我国圈养华南虎疫病防控与诊疗提供理论参考依据。

1 材料和方法

1.1 病例来源及背景

送检的1例75日龄急性死亡的华南虎幼虎，该小虎死亡前1 d，表现精神沉郁、不爱走动、嗜睡、拉黑色软便。

1.2 病理剖检

剖检前观察被毛光泽度、精眼睑、鼻孔等有无分泌物及其他异常情况。然后进行剖检，依次观察心、肝、脾、肺、肾及淋巴结等组织器官的病变情况，打开颅腔观察脑组织病变情况，拍照保存并做好相关记录。病料采集时注意无菌操作，全部组织样品均分为2份，1份置于10%中性福尔马林溶液中固定，常规石蜡切片，用于HE染色光镜观察组织病理学变化；1份置于-20℃冰箱保存。

1.3 病原检测

福建梅花山华南虎繁育研究所

1.3.1 主要试剂 DL500 DNA Marker、LATaqDNA聚合酶、2×GC Buffer I、dNTP、Universal Genomic DNA Extraction Kit、pMD18-T克隆载体均购自宝生物工程（大连）有限公司；DH5α感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3.2 引物设计与合成 根据病理剖检观察，对疑似病例进行猫细小病毒（F P V）、犬瘟热（CDV）、猫疱疹病毒I型(FHV-1)以及猫杯状病毒（FCV）等病原PCR检测，根据GenBank中登录的FPV全基因组序列（KX685354.1），CDV全基因组序列（MF041963.1），FHV-1全基因组序列（KR381803.1）和FCV全基因组序列（KJ495730.1）分别设计合成鉴定引物，FPV-JD-F：5'-GGTGGAAATCACAG CAAACTCA-3'，FPV-JD-R：5'-TTAAACCAAAC T C C C C A A G C A-3'； C D V-J D 2 4 0-F：5'-GAAATCAACGGACCTAAAT-3'，CDVJD240-R：5'-TCCTTGAGCTTTCGACCCTT-3'；FHV-JD288-F：GACGTGGTGAATTATCAG，FHV-JD288-R：CAACTAGATTTCCACCAGG；FCV-JD926-F：AACCTGCGCTAACGTGCTT，FCV-JD926-R：CAGTGACAATACACCCAGAA，引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.3.3 PCR扩增与测序 根据TaKaRa公司Universal Genomic DNA Extraction Kit试剂盒和Trizol说明书提取组织DNA和RNA，利用上述鉴定引物扩增FPV VP2基因片段。PCR体系（25 μL）：DNA模板1 μL、2×GC Buffer I 12.5 μL、dNTP 4 μL、上下游引物各1 μL、LATaq酶0.25 μL，用ddH2O补至 25 μL。 PCR程序：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min。RNA模板经反转录后按上述步骤进行PCR扩增。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。将阳性PCR产物送Invitrogen公司测序，序列与GenBank中FPV序列进行比对分析。

1.4 病理组织学检查

集其心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑等组织，用10%中性福尔马林固定，按常规方法，依次进行冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片和烤片，经

对死亡幼虎进行病理解剖，采H.E染色和加拿大树胶封片，在显微镜下观察病理组织变化。

2 结果

2.1 病理剖检结果

死亡幼虎表现极度消瘦，被毛粗乱、眼睑、鼻孔处未见明显分泌物，后肢及肛门周围被黑色排泄物污染（图1A）。死亡幼虎的病理剖检结果：幼虎血液较为稀薄；病变主要集中在消化道，从胃开始整个消化道内有大量的焦油样的黑色内容物，进一步观察发现胃粘膜表面有许多大小不一的溃疡灶，小肠各段肠粘膜脱落，并伴有严重的充血及出血现象（图1I～M）；大肠至肛门各段肠粘膜也呈现出明显的充血、出血及脱落现象（图1N）；脑膜充血（图1F）；胰脏出血（图1H）；心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及气管均未见明显的病理变化（图1B～E, G）。

图1 死亡幼虎病理剖检结果Fig.1 The autopsy lesions of the dead tiger cub

2.2 病原检测

FPV引物在200 bp左右扩增出1条特异条带，与预期片段大小相符（图2），其他引物未扩增出特异条带，表明死亡幼虎的肠道组织中FPV核酸，初步确定此虎感染FPV。将该PCR产物送Invitrogen公司测

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，序，结果显示该序列与GenBank中登录的FPV HNZZ1株（GenBank登录号：KX685354.1）全基因组2801～2992位碱基序列相似度为100%（图3）。由此表明，FPV感染有可能是导致该幼虎发病死亡的主要因素。

图2 感染幼虎的FPV 基因片段PCR扩增结果Fig.2 PCR Amplification of FPV gene fragment from intestinal tissue of the dead tiger cub

图3 感染幼虎FPV部分基因（FDV-Tiger）与参考基因序列（FPV HN-221株）比较Fig.3 Comparison of nucleotide sequences between FPV gene fragment from the dead tiger cub and reference strains

2.3 病理组织学检查

病理切片镜检结果显示，死亡幼虎心脏组织中部分的心肌纤维发生断裂，心肌毛细血管扩张、充血（图4A）；肝脏组织中肝窦内有大量红细胞，有部分肝细胞发生颗粒变性，部分细胞呈淡染、胞核溶解，成局部坏死灶（图4B）；脾脏组织疏松，并伴有淤血现象，脾窦内有大量红细胞，脾小体内淋巴细胞发生溶解，呈空泡化（图4C）；肺脏组织以出血为主要的病理变化，表现为肺泡壁增厚，肺泡内部充满了大量的红细胞；部分的间质增宽，有炎性细胞浸润，从而使肺泡发生不规则变形（图4D）；肾脏组织中可见大量肾小管上皮细胞变性、坏死脱落，使部分肾小管仅剩下基底膜。在肾小管间有大量胞核深染为蓝色的炎性细胞，部分肾小管官腔内及小管间有大量红细胞浸润。大量肾小球分裂并伴有出血现象，部分肾小球萎缩甚至消失（图4E、F）；脑组织中小胶质细胞浸润，毛细血管充血，部分神经元发生了核溶解现象，形成镜下可见的空泡化。同时可见个别神经元因小胶质细胞环绕而形成卫星现象即小胶质细胞噬神经元现象（图4G）；胰脏组织中以出血为主要的病理变化，在胰脏毛细血管内及腺泡间充满大量的红细胞（图4H）；食管各部分组织结构完整，未观察到明显的病理变化（图4I）；胃病理切片在镜下可见胃粘膜出血，大量胃粘膜上皮细胞坏死、脱落，严重部位粘膜层基本消失。粘膜固有层及粘膜下层有大量炎性细胞浸润（图4J）；肠道病理切片观察可见小肠及大肠各段均以出血、肠绒毛大量坏死、脱落，并伴有大量炎性细胞浸润为主的病理变化，其中，以十二指肠段及直肠段病变较为严重，十二指肠绒毛间可见大量的红细胞；直肠粘膜严重变性，粘膜上皮细胞大量坏死脱落，并伴有出血现象（图4K、L）。病理切片镜检结果进一步说明，该幼虎可能因感染FPV而导致各种主要器官严重的病料损伤。

3 讨论

华南虎亦称“中国虎”，国家一级保护珍稀濒危动物，是中国特有的虎亚种。目前华南虎种群的近交系数高、群体小，而且对华南虎现在流行的病毒性传染病没有流行病学的系统调查[11]。近年来我国不断有圈养华南虎感染疫病的报道，表明疫病已威胁到我国华南虎群的繁殖保护工作[1,7,11]。

本研究通过对死亡华南虎幼虎的病史调查，发现该病例病程较急，幼虎死亡前精神沉郁、拉黑色稀粪；病理剖检发现死亡幼虎极度消瘦、被毛粗乱、有脱水现象，从胃开始整个消化道内有大量的焦油样的黑色内容物，进一步观察发现胃粘膜表面有许多大小不一的溃疡灶，小肠各段肠粘膜脱落，并伴有严重的充血及出血现象。综上初步判断，消化道出血及腹泻造成机体严重脱水，并怀疑造成消化道严重损伤的原因可能是消化道病原感染。

图4 死亡幼虎不同器官组织的病理切片结果Fig.4 The pathological section results of different organs in the dead tiger

猫细小病毒（Feline parvovirus virus，FPV）是典型的肉食兽细小病毒[12]。在自然条件下，该病毒能够感染多种野生猫科动物，如狮子、老虎、豹以及水貂等[13]。感染FPV的标志就是患病动物会发生腹泻，这是因为小肠绒毛的减少导致了上皮细胞的丢失或完全丧失[14]。PCR方法是近年来检测猫细小病毒常用的方法之一，与HA/HI、ELISA、病毒分离等方法比较，PCR技术更简便、快速、敏感[15]。乔军等[16]曾应用PCR方法检测了东北虎感染FPV，其敏感性远高于血凝试验的敏感性。因此，本研究采用FPV特异性鉴定引物对死亡幼虎的肠道组织中的病原体进行了PCR检测，结果在200 bp左右扩增出一条特异性条带，与预期片段大小相符，对目的片段的测序结果证实死亡幼虎感染了FPV，这可能是导致其发病死亡的主要原因。同时，病理组织切片镜检结果显示，死亡幼虎胃、肠粘膜出血，大量粘膜上皮细胞坏死、脱落，严重部位粘膜层基本消失，并伴有大量炎性细胞浸润；心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑等组织也均有较为严重的病理损伤，说明FPV感染对幼虎多种主要器官造成了严重的损伤。

综合分析发现，FPV感染幼虎能引起严重的消化道症状，并造成消化道在内的多个器官的严重病理损伤。今后，针对该病的防控过程中应注意加强饲养管理，做好生物安全工作，定期进行环境清洗消毒；对于发病动物应当及时发现、及时治疗，对症治疗的同时给予辅助药物来改善患虎的食欲、增强抵抗力。

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A CASE OF FELINE PARVOVIRUS VIRUS INFECTION OF A SOUTH CHINA TIGER

HUANG Cui-qin1,2, FAN Ke-wei1,2, YU Jia1,3, FU Wen-yuan3, LIN Kai-xiong3, YANG Shou-shen1,2, LIN Qing-qing1, YANG Xiao-yan1,2
(1. College of Life Sciences, Longyan University, Longyan 364000, China; 2. Fujian Engineering Research Center for Swine Disease
Control and Prevention, Longyan 364012, China; 3. College of Animal Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350001,China; 4. Fujian Meihuashan Institute of South China Tiger Breeding, Longyan 364201, China)

In order to diagnose an acute death of a cub suspected of Feline parvovirus virus (FPV) infection in Fujian Meihuashan Institute of South China Tiger Breeding, clinical samples were examined using necropsy, PCR and histopathology. The FPV VP2 gene was positive in intestinal tissues, and serious damages were observed in histopathologic slides of multiple organs. These results indicated that the tiger cub was infected with FPV.

South China tiger; Feline parvovirus virus; PCR; histopathology

2017-08-18

国家自然科学基金青年科学基金项目（31602048）；福建省科技厅自然科学基金面上项目（2016J01712）；龙岩学院产学研合作项目（LC2015010）；龙岩学院校级协同创新中心项目；国家林业局野生动物疫源疫病监测和预警系统维护项目

黄翠琴，女，副教授，主要从事动物疫病的诊断研究

范克伟，E-mail：fankewei8399@163.com

S852.659.2

A

1674-6422（2017）06-0043-05