禽内源性反转录病毒ALVE1在鸡基因组上下游序列鉴定

戴振清，胡序明，王 芳，陈世豪，贾崇信，豆春峰，耿拓宇，崔恒宓

（1.扬州大学表观遗传学及表观基因组学研究所，扬州 225009；2. 扬州大学动物科学和技术学院，扬州 225009）

禽内源性反转录病毒ALVE1在鸡基因组上下游序列鉴定

戴振清1,2，胡序明1,2，王 芳1,2，陈世豪1,2，贾崇信1,2，豆春峰1,2，耿拓宇1,2，崔恒宓1,2

（1.扬州大学表观遗传学及表观基因组学研究所，扬州 225009；2. 扬州大学动物科学和技术学院，扬州 225009）

已知鸡基因组中含有禽内源性反转录病毒ALVE1序列，而ALVE1在鸡基因组中的上游和下游区域位置在参考基因组中并未成功鉴定。本研究成功鉴定出ALVE1所在鸡基因组中的上、下游序列，并通过提取CEF细胞和DF-1细胞基因组反过来验证了ALVE1的位置信息。与参考基因组不同的是，我们发现ALVE1序列包含3'LTR序列，在鸡1号染色体上的插入位置为chr1:65,995,534～65,993,540。本研究不仅提供了ALVE1在鸡基因组中的完整信息，也为进一步研究ALVE1的功能奠定了基础。

禽内源性反转录病毒；ALVE1；鉴定

内源性反转录病毒（endogenous Retroviruses）是基因组成分，以其“前病毒”形式存在，几乎在所有哺乳动物（如人、鼠、猫和羊）和脊椎动物（如鸡）基因组中存在。作为远古反转录病毒感染在宿主体内的残留，过去对它的功能不够了解，曾将其视为垃圾DNA（Junk DNA）。直至最近有研究表明，某些内源性反转录病毒不仅对早期胚胎发育和胚胎干细胞的多能性具有重要作用[1-3]，还可能与细胞天然免疫有关[4-6]。

目前，在鸡基因组中已鉴定多种类型的内源性反转录病毒，但其基因组结构都与禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）类似[7]。禽白血病病毒属于禽反转录病毒科C型肿瘤病毒，在自然界以内源性（ALVE）和外源性（如ALVA、ALVB、ALVC、ALVD和ALVJ）两种形式存在[8]。禽内源性白血病病毒ALVE是最早发现的内源性反转录病毒，可能与宿主免疫应答和遗传抗性有关[9,10]。早期对鸡的研究发现：内源性反转录病毒ALVE的env转录物能够降低细胞受体的活性，从而保护机体免受外源性反转录病毒的感染[11]；体外实验进一步证实内源性ALVE和外源性反转录病毒env转录物之间存在相互干扰[12]。特别是，来源于鸡1号染色体上的内源性反转录病毒ALVE1与禽白血病病毒高度同源，可能与禽白血病病毒的感染和增殖具有一定关联。

本研究首先分析了禽内源性反转录病毒与外源性禽白血病毒病毒的序列同源性和进化关系，然后以鸡胚成纤维细胞（chicken embryo fibroblast，CEF）为研究对象，鉴定了ALVE1在鸡1号染色体的具体插入位置信息，为进一步分析ALVE1的功能奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 细胞

SPF白羽种鸡蛋由北京梅里亚维通实验动物技术有限公司提供，孵化至10日龄后，按常规方法制备CEF；DF-1细胞由教育部禽类预防医学重点实验室秦爱建教授馈赠。

1.2 主要试剂

TRIzol® Reagent和SMARTer® RACE 5'/3'Kit购自日本TaKaRa公司，AxyPrep基因组DNA小量试剂盒购自美国Axygen公司，胎牛血清和DMEM培养基购自GIBCO公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.3 序列同源性分析和系统进化树构建

利用 DNAMAN 8.0 和 MEGA 6.0 软件进行序列同源性分析和系统进化树构建，病毒序列信息见表1。

表1 本研究所使用的病毒序列信息Table 1 Viral sequences information used in this study

1.4 cDNA 末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends, RACE）

由TaKaRa公司提供的SMARTer® RACE 5'/3'Kit试剂盒来完成。首先，用TRIzol®Reagent提取总RNA，然后用RNase-free DNase I 去除基因组。在 SMART Scribe Reverse Transcriptase 的作用下分别将1 g去除DNA的RNA逆转录合成 5'-或 3'-RACE产物。然后利用通用引物UPM和基因特异性引物（gene-specific primer，GSP）扩增，克隆测序获得目的RNA序列的5'端及3'端全长序列。最后，通过PCR克隆测序获得目的RNA的全长序列。

1.5 反式PCR

通过反式PCR获得ALVE1插入位置及其上游序列，简要步骤如下：首先，将大约1 μg鸡胚成纤维细胞基因组DNA通过BamHI、SacI或XhoI限制性酶（ALVE1序列中含有的酶切位点）进行酶切；然后，通过苯酚-氯仿抽提和乙醇沉淀进行纯化，T4 DNA连接酶16℃过夜连接，连接产物通过TA克隆测序。

1.6 引物设计合成

根据GenBank公布的禽内源性反转录病毒ALVE1（GenBank登录号：AY013303.1），采用Primer 3.0和Primer Express 3.0软件设计引物并委托Invitrogen公司合成，引物序列见表2。

表2 本文所使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.7 基因组提取

按照AxyPrep基因组DNA小量试剂盒说明书操作步骤提取基因组，简要步骤如下：收集细胞后，离心去上清液并加入350 μL PBS；加入0.8 μL RNase A，漩涡振荡15 s，室温静置1 min；加入150 μL Buffer C-L和8 μL Proteinase K，立即漩涡振荡1 min混合均匀后56℃水浴10 min；加入350 μL Buffer P-D，漩涡振荡30 s混合均匀，12 000×g离心10 min。然后，依次加入500 μL Buffer W1，12 000×g离心1 min洗涤1次和700 μL Buffer W2，12 000×g离心1 min洗涤2次。最后加入100～200 μL Eluent buffer或去离子水，室温静置1 min，12 000×g离心1 min洗脱DNA。

2 结果与讨论

2.1 禽内源性反转录病毒ALVE1序列同源性和进化树分析

根据GenBank公布的禽内源性反转录病毒（E亚群禽白血病病毒）和不同亚群的禽白血病病毒（A、B、C、D和J亚群）核苷酸序列进行同源性和进化树分析，结果如图1所示，禽内源性反转录ALVE1与不同亚群的禽白血病病毒在序列上高度相似，序列同源性高达85%以上，进化上高度保守。由于ALVE1与其对应的外源性反转录病毒高度同源，因而可作为理想的研究模型去揭示内源性反转录病毒在基因组中的功能和作用。研究发现，SPF鸡胚中存在内源性反转录病毒ALVE1全基因组序列[13]。过去的研究已成功建立禽内源性反转录病毒ALVE表观遗传学分析方法[14]；并且禽内源性反转录病毒ALVE1含有完整的LTR，是控制禽内源性反转录病毒ALVE1转录活性的一个关键因素，其自身转录受到DNA甲基化调控[15]。因此，进一步确定ALVE1在鸡基因组中的具体位置信息，对研究ALVE1的功能十分重要。

2.2 禽内源性反转录病毒ALVE1末端序列及其在染色体上插入位置鉴定

我们发现目前对ALVE1在1号染色体上的拼接位置信息有误。根据UCSC Genome Browser Gallus_gallus-4.0/galGal4公布的ALVE1在鸡1号染色体的位置信息为chr1:32,561,736～32,568,952，仅含有7217 bp且缺少完整的ALVE1 3'LTR序列（见图2A）。尽管最新Gallus_gallus-5.0/galGal5版本公布的信息纠正了这一错误，即ALVE1含有完整的ALVE1 3'LTR序列（图2B）。然而，根据这些位置信息设计引物均未能扩增出ALVE1在1号染色体上的上、下游序列，由此说明目前对ALVE1在1号染色体上的拼接位置信息有误。本研究鉴定发现ALVE1在鸡1号染色体上的拼接位置为chr1:65,995,534～65,993,540（图2C）。首先，通过RACE确认ALVE1在1号染色体含有完整的3'末端LTR序列，并且确认其在染色体的插入位置及其下游序列（图3）。同时，利用反式PCR鉴定出ALVE1 5'末端在染色体的插入位置及其上游序列,且通过设计上游和下游引物进行常规PCR扩增和克隆测序，再次确认了ALVE1在鸡1号染色体的插入位置信息及其上、下游序列（图4）。

2.3 禽内源性反转录病毒ALVE1在鸡基因组中的位置验

图1 禽内源性反转录病毒ALVE1同源性和进化树分析Fig.1 Homology and phylogenetic tree analysis of Avian endogenous retrovirus ALVE1

根据上述结果获得的ALVE1在鸡1号染色体的插入位置信息及其上、下游序列设计PCR引物（图4A）；通过常规PCR扩增，从原代鸡胚成纤维细胞CEF基因组扩增出全长为7525 bp的序列（图4B）。而对照组DF-1细胞基因组未能扩增出预期大小的条带（图4B）。反过来，DF-1细胞基因组无ALVE1序列，因而在ALVE1插入位置，上、下游序列设计两对引物可以分别扩增出理论大小1800 bp或1400 bp的条带；而CEF细胞基因组有ALVE1，因此在相同位置不会扩增出条带（图4C）。由此，本研究确定了ALVE1在鸡1号染色体的插入位置、片段大小和插入位置上、下游序列。

图2 禽内源性反转录病毒ALVE1在鸡基因组中的位置图示Fig.2 Schematic overview Avian endogenous retrovirus ALVE1 in the chicken genome

图3 禽内源性反转录病毒ALVE1在鸡基因组中的上游和下游序列示意图及扩增Fig.3 identification of upstream and downstream of Avian endogenous retrovirus ALVE1 in the chicken genome

图4 验证禽内源性反转录病毒ALVE1在基因组中的上游和下游序列Fig.4 Verification of upstream and downstream sequences of ALVE1 in the chicken genome

本研究提供了一种鉴定内源性反转录病毒序列在染色体上的插入位置鉴定方法，即通过RACE鉴定内源性反转录病毒m RNA的末端序列并结合反式PCR技术，反推其在染色体中的位置，这为今后鉴定基因组中的病毒序列提供了一种有效的方法。同时，本研究对禽内源性反转录病毒ALVE1在鸡1号染色体的插入位置信息及其上、下游序列进行重新鉴定和验证，为进一步研究ALVE1的功能奠定了基础。

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IDENTIFICATION OF UPSTREAM AND DOWNSTREAM SEQUENCES OF AVIAN ENDOGENOUS RETROVIRUS ALVE1 IN THE CHICKEN GENOME

DAI Zhen-qing1,2, HU Xu-ming1,2, WANG Fang1,2, CHEN Shi-hao1,2, JIA Chong-xin1,2, DOU Chun-feng1,2,GENG Tuo-yu1,2, CUI Heng-mi1,2
(1. Institute of Epigenetics and Epigenomics, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China; 2.College of Animal Science and Technology,Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)

The chicken genome contains endogenous avian leukosis viral element on chromosome 1 (ALVE1). However, the upstream and downstream sequences flanking region of the ALVE1 element remains unidentified in the reference genome. In this study, the upstream and downstream sequences of ALVE1 in the chicken genome were identified using RACE and inverse PCR, and confirmed by PCR Amplification. In addition, the location of ALVE1 was verified using CEF and DF-1 cell genomes. Here, the complete sequences containing the upstream and downstream of ALVE1 element were figured out with genomic DNA from CEF cells. Unlike the reference genome, ALVE1 element contained 3'LTR sequences on chicken chromosome 1 (position: 66086818-66086750). This study not only provided the complete information of ALVE1 in the chicken genome but also provided a basis for further study on the function of ALVE1.

Avian endogenous retroviruses; ALVE1; identification

2017-10-9

国家自然科学基金重大研究计划(91540117)；国家自然科学基金面上项目（81372237）；国家自然科学基金青年基金项目（31602032）；江苏省畜牧学优势学科项目；江苏省高等学校大学生创新创业训练计划项目（201611117037Z）

戴振清，女，硕士研究生，特种经济动物饲养专业

崔恒宓，E-mail：hmcui@yzu.edu.cn

S852.659.3

B

1674-6422（2017）06-0064-06