基于半胱胺修饰传感器对五羟色胺的测定研究

宋泽萱，刘 肖，康维钧，牛凌梅*

（河北医科大学公共卫生学院，河北石家庄050017）

0 引言

5-羟色胺 (5-hydroxytryptamine，5-HT)亦称血清素(serotoin)，是色胺酸的代谢产物。色胺酸在组织中经过色胺酸羟化酶和5-羟色胺酸脱羧酶的作用生成5-羟色胺，又经单胺氧化酶作用生成5-羟色醛；进一步氧化成5-羟吲哚乙酸[1]。5-羟色胺是人体内重要的神经递质，其参与睡眠、摄食、体温、学习、记忆等多种生理过程。中枢神经系统5-HT含量异常与重性抑郁障碍和自杀行为有着极其重要的联系，同时也可以影响血脑屏障通透性的改变[2]。

目前，测定5-HT含量的方法有很多，例如：免疫法[3-4]、荧光法[5]、高效液相色谱法[6-8]、电化学方法[9-11]等。免疫荧光法灵敏度较差，高效液相色谱法费时繁琐，多需要样品前处理。而电化学方法简便、快速、灵敏等优点吸引了研究者很大兴趣。迄今为止，已有很多用修饰电极测定5-HT的报道，例如：以聚酚红花红修饰电极[12]、碳纳米管膜修饰玻碳电极[13]、 碳纳米管插层石墨电极[14]、铁酞菁配合物修饰碳糊电极[15]测定5-HT，但用半胱胺(CYS)修饰金电极的方法还未曾报道，5-HT反应机理也未曾探究。该实验拟利用CYS修饰金电极，制备自组装膜传感器，并在此基础上建立5-HT的定量检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器与实验材料

CHI650D电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)；采用三电极系统：铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，CYS/Au电极为工作电极。扫描电镜：日本日立公司S-4800型扫描电镜，扫描电位0～3 kV。

半胱胺(0.01mol/L)购于Sigma试剂公司，5-HT(0.001mol/L)购于中国药检所，其余试剂为分析纯，实验用水为超纯水。

1.2 半胱胺修饰电极的制备

分别用0.3，0.05μm三氧化铝悬浆将裸金电极(直径 2mm)打磨至镜面，浸入在Piranha溶液中15min，再分别用无水乙醇和超纯水各超声5 min。清洗后的金电极置于0.1mol/L硫酸溶液中，在-0.2～1.6 V电位范围内扫描至稳定[16-17]。将清洗好的电极浸入到0.01mol/LCYS溶液中6 h，取出反复用超纯水冲洗以除去物理吸附的物质，得到半胱胺修饰金电极(CYS/Au)。

2 结果与讨论

2.1 扫描电镜对CYS/Au电极的表征

图1 裸电极（A）和CYS修饰电极（B）的扫描电镜图Fig.1 Scan electron microphoto graph of bare(A)and CYSmodified electrode(B)

利用扫描电镜对裸金电极和CYS/Au修饰电极的表面形貌进行了探究。如图1(A)所示，未修饰任何物质时，裸金电极表面呈不规则、不平整、较粗糙的状态，可见明显沟壑。经半胱胺修饰后，电极表面粗糙不规则的状态大大改善，表面光滑平整，沟壑基本消失(如图1(B)所示)，可推测半胱胺已经修饰于金电极表面。

2.2 5-HT在半胱胺修饰金电极上的电化学响应利用差分脉冲法研究了5-HT在裸金电极及

修饰电极上的电化学响应（图2）。在裸金电极表面，5-HT的氧化峰电流为3.195×10-7A。而在半胱胺修饰电极表面，5-HT氧化电流大大增加(6.686×10-7A)，峰电流增加了109%，而且氧化峰电位有了一定的降低。这可能是由于半胱胺修饰膜中的羧基与5-HT中的羟基形成了分子内氢键，从而加速了电子的传递，提高了识别的灵敏度。可见，修饰电极对5-HT的氧化能够起到明显的电催化作用，灵敏度大大增加。

2.3 半胱胺修饰时间对5-HT测定的影响

利用差分脉冲伏安法研究了半胱胺修饰膜组装时间对5-HT测定的影响。将处理好的电极分别组装 4 h，5 h，6 h，12 h，20 h，30 h 进行修饰，并测量5-HT电流峰值。如图3所示，随着半胱胺组装时间的延长，5-HT的响应峰电流也随之增大，这可能是由于随着半胱胺组装时间的延长，其所吸附的量也随之增加，对5-HT测定的催化能力也逐渐增加，因此电流逐渐增大。但当时间超过6 h后，氧化电流增加趋于平缓，说明电极表面吸附的半胱胺已趋于饱和。因此，选用6 h作为最佳组装时间。

图2 裸电极(b)和CYS/Au(a,c)电极在5-HT溶液中（b,c）和空白溶液（a）中差分脉冲曲线。 浓度：1.0×10-4 mol/L；缓冲溶液pH：7.0；扫描速度：0.1 V/sFig.2 Differential pulse voltammetry(DPV)curves at bare gold electrode(b)and CYS/Au electrode(a,c)in the presence(b,c)and absence(a)of1.0×10-4 mol/L 5-HT.pH of phosphate buffer:7.0;Scan rate:0.1 V/s

2.4 支持电解质pH对5-HT测定的影响

图3 半胱胺修饰时间对5-HT氧化峰电流的影响5-HT 浓度：1.0×10-4 mol/L ；缓冲溶液 pH：7.0；扫描速度：0.1 V/sFig.3 Effect of modification time of CYS on the anodic peak current of5-HT in phosphate buffer.5-HTconcentration:1.0×10-4 mol/L;pH of phosphate buffer:7.0;Scan rate:0.1 V/s

在不同pH值的磷酸缓冲溶液中用差分脉冲伏安法研究了支持电解质对5-HT测定的影响。如图4(A)所示，当底液pH值从4.5增至5.5时，峰电流也随之增加，然而当底液pH值进一步增加时，峰电流却逐渐下降，因此试验选择pH5.5的磷酸盐缓冲溶液作为底液来检测五羟色胺。如图4(B)所示，在pH4.5～pH7.5范围内，随着pH增加，5-HT的氧化峰电位逐渐减小且呈良好的线性关系，线性回归方程为Ep=-0.062pH+0.77(r:0.9949)，斜率为62mV/pH，与能斯特方程理论值(59mV/pH)接近，这表明电子转移数与质子转移数相等[18-20]。

图4 （A）缓冲溶液pH对5-HT氧化峰电流的影响；（B）缓冲溶液pH对5-HT氧化电位的影响5-HT 浓度：1.0×10-4 mol/L；扫描速度：0.1V/sFig.4 (A)Effect of pH on the anodic peak current in phosphate buffer;(B)Effect of pH on the anodic peak potential in phosphate buffer.5-HT concentration:1.0×10-4 mol/L;Scan rate:0.1 V/s

2.5 扫描速率对电极响应的影响

利用循环伏安法考察了扫描速率对5-HT在半胱胺修饰电极表面电化学响应的影响。所有的峰电流均与扫描速率的平方根呈线性关系，线性回归方程为ip=0.84v1/2+4.7(r:0.9957;ip:10-7A)表明电极反应是受扩散控制的过程。5-HT在修饰电极上，峰电流随扫描速度的变化如图5。

2.6 分析应用

图5 扫描速度对5-HT氧化峰电流的影响。5-HT浓度：1.0×10-4 mol/L；缓冲溶液 pH：5.5Fig.5 Effect of the scan rate on the anodic peak current in phosphate buffer.5-HT concentration:1.0×10-4 mol/L;pH of phosphate buffer:5.5

利用差分脉冲法(DPV)研究了5-HT在半胱胺修饰电极上检测的线性关系。实验结果如图6所示，发现5-HT的氧化峰电流在5.0×10-7～7.0×10-5mol/L范围内均随着其浓度的增加而线性增加，线性方程为ip=0.046 c+0.058(r:0.9966,c:10-6mol/L,ip:10-7A)，检出限为 2.8×10-8mol/L。

2.7 CYS/Au电极的稳定性

在1.0×10-5mol/L的5-HT溶液中考察了半胱胺修饰金电极的稳定性。10次连续测定之后，5-HT的峰电流变化在5%以内。将此修饰电极置于蒸馏水中40 d后，仍保留99.5%的电催化活性。以上结果均表明此修饰电极有着很好的稳定性。

2.8 电化学参数计算及反应机制研究

图6 5-HT不同浓度的差分脉冲法曲线图。缓冲溶液pH：5.5；扫描速度：0.1V/sFig.6 DPV curves of the various concentration of5-HT.pH of phosphate buffer:5.5;Scan rate:0.1 V/s

为了进一步探讨5-HT在CYS/Au电极上的反应过程，对5-HT反应的电化学参数进行了计算。根据公式[21-22]，计算了5-HT的扩散系数(D)，

A表示修饰电极的表面积 (d=2mm)，n表示电子转移数，此处n=2[23]，D表示扩散系数，c表示5-HT溶液浓度(1.0×10-4mol/L)。由此，计算得出5-HT的扩散系数D为1.2×10-9cm2/s。

根据Ep-pH呈线性关系的实验结果，5-HT的氧化过程可推测为失去两个电子且同时伴随着两个质子的转移，反应机理方程式可表示为

2.9 干扰物质的测定

研究了各种干扰物对5-HT测定的影响。在相对误差 5%限度之内，500 倍的 Na+、Ca2+、K+、Mg2+、SO42+、Cl-，100 倍的谷氨酸、甘氨酸，等倍的肾上腺素，对于测定不产生干扰，说明此电极有很好的选择性。

2.10 样品测定

取3.00mL人体血清加入等体积的甲醇离心沉淀，取出4.00mL上清加入等体积的PBS(pH=5.5)混匀，利用DPV方法进行样品测定。由于5-HT在人体血清中含量极低，故采用加标回收方法验证此修饰电极的稳定性。测得结果如表1所示。

表1 血样中5-HT的测定结果Tab.1 Results for the determination of5-HT in serum samples

3 结论

制备了半胱胺修饰的金电极，并用差分脉冲伏安法研究了5-HT在此修饰电极上的电化学行为。实验结果证明半胱胺修饰金电极与裸金电极相比，对5-HT的氧化起到明显的电催化作用，测定的灵敏度大大提高，且稳定性良好。在此基础上考察了测定5-HT的优化条件以及线性范围，结果发现，5-HT的氧化峰电流与其浓度在5.0×10-7～7.0×10-5mol/L范围内呈良好的线性关系，检出限达到2.8×10-8mol/L，准确度高，可广泛应用于样品测定。

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