微量有机磷农药胁迫对家蚕血液中部分生命元素含量的影响

赵炎坤 张玉琴 周 沂 杨仁奎 冯丽春

(1.西南大学生物技术学院，重庆 400716; 2.成都市川化中学，四川 成都 610300；3.重庆市蚕业科学技术研究院，重庆 400700)

微量有机磷农药胁迫对家蚕血液中部分生命元素含量的影响

赵炎坤1，2张玉琴1周 沂1杨仁奎3冯丽春1

(1.西南大学生物技术学院，重庆 400716; 2.成都市川化中学，四川 成都 610300；3.重庆市蚕业科学技术研究院，重庆 400700)

通过微量浓度(0.05mg/L)辛硫磷在5龄家蚕的添毒处理，测定处理后家蚕血液中部分生命元素K、Na、Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Zn的含量变化。实验结果表明：正常5龄家蚕血液中大量元素K、Na、Ca、Mg的含量是Ca>Na>Mg>K，经过微量辛硫磷处理后Ca、Na含量降低，Mg、K含量升高；正常5龄家蚕血液中微量元素Fe、Mn、Cu、Zn的含量是Fe>Cu>Zn>Mn，经过处理后Fe、Cu含量升高，Mn、Zn含量降低。

辛硫磷；胁迫；家蚕；血液；生命元素

有机磷农药是我国使用广泛、用量最大的杀虫剂，由于农药的滥用，环境中的农药残留越来越多，长期接触环境中的残留农药会引发生物体怎样的生理变化、如何对环境中残留的微量农药进行有效检测？这些是现在人们非常关心的问题之一。家蚕由于长期的人工环境饲养，相比于其他野外生存的昆虫，对自然环境的变化适应变弱，尤其是对各种污染物更加敏感，早已被科学家作为化学物质毒性实验动物。1978年Kodansha Ltd就提出家蚕是一种很重要的实验动物[1]；王凯雄等(2000)利用家蚕进行生物监测研究，在实验中发现，家蚕对于有机磷农药“毒死蜱”的灵敏程度远高于目前市售的“残留农药速测卡”[2]，因此认为家蚕幼虫是一种用于生物监测残留农药的极好材料，值得研究和利用。

组成生物体的元素有90多种，目前公认的生命必需元素有28种，其中包括常量元素和微量元素，这些元素对维持生物的正常生理活动起着重要的作用。关于生命元素的研究在人和动物中报道较多，尤其是在人类健康方面。相比而言，在家蚕方面的研究较少。家蚕是鳞翅目昆虫的代表，其循环系统是开放式的循环系统，血液为组织器官提供一个比较稳定的环境，血液及循环系统承担着物质运输、贮存、代谢，维持正常血压、渗透压、离子平衡，免疫应答，修补伤口等重要功能。有关血液的化学组成，对其蛋白质、氨基酸、碳水化合物研究较多， 而对其生命元素的研究甚少。本研究通过微量浓度辛硫磷的添毒，测定5龄雌雄家蚕血液中8种生命元素含量的变化情况， 以期探讨微量有机磷农药胁迫对家蚕血液中部分生命元素含量的影响。

1 材料与方法

1.1 供试家蚕

生产用限性品种：秋丰，由重庆市蚕业科学研究院提供。

饲养条件：专用蚕房，常规饲养，普通桑叶饲喂。

1.2 主要试剂和仪器

辛硫磷原药(纯度>95%)(购自原重庆市井口农药厂)、丙酮、吐温20、双蒸水等；

日立Z-5000型原子吸收分光光计、AP1401型火焰分光光度计、电子天平、移液枪、干湿温度计、纯水仪等。

1.3 微量农药添毒处理

将辛硫磷原药按照一定比例用双蒸水加1mL丙酮、20μL吐温配置成0.1ml/L母液，装入棕色瓶中避光保存备用。家蚕按照常规方法饲喂至5龄，选出发育状态一致的用于实验。分雌雄设置处理组及对照组，每组三个重复区，每区100头蚕。用先前配置好的辛硫磷母液配置成6份0.05mg/L的实验药液，每份1000mL(每天现用现配)。称取去除主叶脉的新鲜桑叶，每份50g，桑叶按照“浸叶法”完全浸入实验药液，1min后取出避光晾干后喂蚕，对照组则用清水代替药液。每天饲喂二次浸药桑叶，其余饲喂正常桑叶。每次饲喂浸药桑叶前把蚕盒中未被食用桑叶清理干净。

1.4 钾、钙、钠、镁、铁、锰、铜、锌含量的测定

1.4.1 样品处理

在用微量辛硫磷添毒后的1d、3d、5d、7d对雌雄家蚕分别进行腹足取血，装入1.5mL离心管中，5000rpm离心5min，吸取上清1mL转移到玻璃试管中，进行湿法消化处理。先在样品管中加入10mL的王水(HNO3∶HCL=1∶3)摇匀，静置2h，然后放入沸水中煮30min。待温度降到室温，再把样品转移到干净的容量瓶中，定容至25mL。

1.4.2 测定方法

把定容好的样品分别用原子吸收分光光度计和火焰光度计测定5龄雌雄家蚕血液中K、Na、Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Zn等元素的含量。

1.4.3 含量计算

按如下公式计算： 元素含量(mg/L)=所测数值×定容体积/所取体积

式中：定容体积为25ml，吸取的体积为1ml

2 结果与分析

2.1 家蚕血液中几种常量元素的含量变化

通过测定家蚕血液中的K、Na、Ca、Mg 4种常量元素含量，结果如表1、图1所示。对照组雌雄之间这几种常量元素平均含量是有一定的性别差异，K和Mg都是雄蚕高于雌蚕，而Na和Ca则是雄蚕含量比雌蚕低；在所测定的4种常量元素中,以Ca含量最高，雌雄蚕分别达到 3066mg/L和2915mg/L，其次分别是Na、Mg、K。经微量辛硫磷农药添食处理后4种元素的含量依然是Ca>Na>Mg>K，处理组和对照组之间的比较可以看出，添食处理后Ca、Na含量降低，雌雄蚕Ca含量分别下降1.8%和0.8%，Na含量下降幅度分别为8.3%和10.7%；Mg、K含量处理后升高, 雌雄蚕Mg含量升高幅度分别为3.9%和1.8%，K含量分别升高21.2%和18.3%。

表1 家蚕血液中几种常量元素含量测定

图1 对照组和处理组几种常量元素含量对比(mg/L)

2.2 家蚕血液中几种微量元素的含量变化

添食处理后测定了家蚕血液中的Fe、Mn、Cu、Zn 4种微量元素含量，结果如表2、图2所示。对照组雌雄蚕血液中这几种元素也是存在性别差异的，其中Fe、Zn、Cu都是雄蚕高于雌蚕，Mn则是雄蚕低于雌蚕，在所测定的4种微量元素中，以Fe含量最高，雌雄蚕分别达到 12.746mg/L和 18.812mg/L，其次分别是Cu、Zn、Mn。经微量辛硫磷农药添食处理后4种元素的含量总的趋势依然是Fe>Cu>Zn>Mn，处理组和对照组之间的比较可以看出，添食处理后Zn、Mn含量降低，雌雄蚕Zn含量分别下降23.5%和41.3%，Mn下降幅度分别为23.0%和32.4%；而Fe、Cu含量升高, 雌雄蚕Fe含量升高幅度分别为32.4%和0.7%，Cu升高幅度分别为15.3%和19.0%。

表2 家蚕血液中几种微量元素含量测定

注：*表示与对照组相比，处理组存在显著性差异；**表示与对照组相比，处理组存在极显著性差异。

图2 对照组和处理组几种微量元素含量对比(mg/L)

3 讨论

家蚕目前已经被公认为生命科学研究的模式生物之一，因为是鳞翅目昆虫，可以很好地代表在农业害虫占很大比重的鳞翅目害虫，所以常用家蚕作为农药毒理实验的动物模型，在研究上主要集中在农药的致死及亚致死方面的毒性实验。如马惠等利用家蚕进行了27种农药毒性评价试验[3]；陈小平等研究家蚕对常用有机磷农药的毒性反应[4]；朱九生等研究了新型生物农药阿维菌素对非靶标的昆虫家蚕的毒理学效应[5]；张聪冲等利用家蚕做了部分有机磷和拟除虫菊酯类农药的毒性研究[6]；Wang Jun等(1999)用亚致死浓度的杀虫双从2龄开始饲喂家蚕，直到上蔟，并记录各龄期发育情况和结茧率等指标，摸索了最低可观察效应剂量[7]；鲁兴萌等(2003)用亚致死浓度氯氰菊酯连续饲喂3龄起蚕后，发现微量氯氰菊酯就会导致眠蚕体重和全茧量的显著下降[8]；李云芝等(2009)用极低浓度苯氧威药液给5龄第3天家蚕添食，观察发现亚致死浓度就会导致龄期延长，不结茧[9]。

本次实验辛硫磷对家蚕的添毒浓度为0.05mg/L，这是在前期一系列预备实验的基础上筛选出来的，此浓度为1/100 LC50(LC50(雌)=0.0049g/L，LC50(雄)=0.0045g/L)。实验结果表明，在微量辛硫磷胁迫下，家蚕血液中部分生命元素含量发生了变化，Ca、Na、Mn、Zn含量降低，Mg、K、Fe、Cu含量升高，这些元素在家蚕的生命活动中具有重要的作用。如赤尾等(1935)研究发现，家蚕化蛹时，体内组织中的Zn、Mn元素会转移到卵巢中[10]；张烈等(2000)做了部分微量元素对家蚕产卵的实验，发现在家蚕4、5龄期，人为添加Zn、Mn元素会能显著提高家蚕产卵量[11]；张国政等人在稚蚕饲料中添加几种微量元素，对稚蚕期的生长发育有明显影响[12]。在微量有机磷农药胁迫下，虽然表观看不出家蚕中毒症状，但血液中部分元素含量的变化表明家蚕对农药的胁迫产生了应急反应，这说明家蚕对有机磷农药是很敏感的，即使受到微量浓度的胁迫，其生理方面都会发生显著变化，但是具体的变化机制及这些元素在蚕体内发挥着什么样的功能，需要进一步研究与验证。

[1] NATIONAL INSTITUTE OF GENETICS. The Silkworm：an important laboratory tool[M]. Tokyo：Kodansha Ltd，1978：269-278.

[2] 王凯雄，陈玉敏，许利君，等. 家蚕用于生物检测初步研究(Ⅱ)[J].中国蚕业，2001，22(1)：12-13.

[3] 马惠， 姜辉，陶传红. 27种农药对家蚕的毒性评价研究[J]. 农药学学报，2005，7(2)：156-159.

[4] 陈小平，青学刚，严欲民. 常用新农药对家蚕的毒力及残效期研究[J]. 四川蚕业，2005，2：12-24.

[5] 朱九生，王静，高海燕，等. 阿维菌素类药物胁迫对非靶标昆虫家蚕的毒理学效应[C].中国环境科学学会学术年会论文集.上海，2010：4278-4282.

[6] 张聪冲，毕道芬，覃春华，等. 部分有机磷和拟除虫菊酯类农药对家蚕的毒性测定[J]. 蚕业科学，2009，2，339-343.

[7] JUN WANG, DAQIANG YIN, GENFA LU, et al. Effects of dimehypo (disodium 2-methylaminotrimethylene di thiosulfonate) on growth and cocooning of the silkworm,Bombyxmori(Lepidoptera: Saturnidae)[J]. Pesticide Science，1999，55(11)：1010-1076.

[8] 鲁兴萌，周勤，周金钱，等.微量氯氰菊酯对家蚕的毒性川[J].农药学学报，2003，5(4)：42-46.

[9] 李云芝，刘文光，石瑞常，等.农药苯氧威对家蚕的毒性试验[J].蚕业科学，2009，35(4)：896-901.

[10] 高见丈夫. 蚕种总论[M]. 北京:农业出版社, 1981.

[11] 张烈，刘重盈，白克明，等.部分微量元素对家蚕产(造)卵性影响研究初报[J].西北农业学报，2009,9(4)：93-95.

[12] 张国政，韦亚东，杨仁政，等.稚蚕人工饲料中几种微量元素的添加效果[J].蚕业科学1996,22(3):145-149.

国家蚕桑产业技术体系建设项目(CARS-22-ZJ0204)。

杨仁奎，高级农艺师，从事家蚕新品种选育及良种繁育工作。E-mail:630525623@qq.com

冯丽春，副教授，硕士生导师。Tel:023-68250173, E-mail:flc1220@aliyun.com