三氧化二砷对胶原诱导性关节炎模型大鼠的抗炎作用

唐 芳 马武开 陈玉婷 姚血明 黄 颖 徐 晖 黄 昆

(贵阳中医学院第二附属医院风湿免疫科，贵州 贵阳 550001)

·基础研究·

三氧化二砷对胶原诱导性关节炎模型大鼠的抗炎作用

唐 芳 马武开 陈玉婷 姚血明 黄 颖 徐 晖 黄 昆

(贵阳中医学院第二附属医院风湿免疫科，贵州 贵阳 550001)

目的探讨三氧化二砷(AS2O3)对牛Ⅱ型胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠血清肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β 水平的影响。方法将60只健康清洁级Wistar大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、雷公藤对照组及AS2O3低、中、高剂量组，每组10只。除空白对照组外，其余各组建立CIA模型，观察AS2O3对CIA 大鼠关节病理、关节炎指数的变化及对TNF-α、IL-1β表达的影响。结果AS2O3能够抑制CIA 大鼠关节肿胀，降低血清TNF-α、IL-1β水平，减轻关节滑膜细胞增生、滑膜层及滑膜下层淋巴细胞浸润，其中低、中剂量组疗效与雷公藤对照组相当(P>0.05)，高剂量组优于雷公藤组(P<0.01)。结论AS2O3能减轻CIA 大鼠关节肿胀程度及关节滑膜淋巴细胞浸润，下调CIA 大鼠血清致炎因子TNF-α、IL-1β 的表达。

三氧化二砷；诱导性关节炎；肿瘤坏死因子-α；白细胞介素-1β

目前研究已经证实肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、-6等细胞因子是造成类风湿关节炎(RA)患者长期关节滑膜炎症反应及关节破坏的主要致炎因子，滑膜细胞中的TNF-α、IL-1β及IL-6等致炎因子通过一系列级联反应，最终激活低化β激酶(IKK)复合体，释放核转录因子(NF)-κB信号，从而调控各种炎症介质基因的表达，促进RA的发生和发展〔1，2〕。TNF-α与IL-1β在滑膜细胞的表达与NF-κB具有一致性〔3〕。因此，控制NF-κB途径的非正常激活，下调炎症细胞因子的表达，成为RA治疗的新途径与切入点。RA属祖国医学“痹证”范畴，传统中医药可通过多途径、多层次、多靶点地作用于人体而发挥调节作用〔4〕。在三氧化二砷(AS2O3)抗肿瘤的研究中，促进细胞凋亡和抑制血管增生是其主要作用机制，RA病理特征为关节滑膜细胞过度增殖和血管增生，类似于恶性肿瘤的发病特点。本课题旨在探讨AS2O3对胶原诱导性关节炎(CIA)模型大鼠关节炎症的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物及条件 清洁健康Wistar大鼠60只，雌雄各半(分笼饲养)，体重(170±15)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK(京)2012-0001。喂养饲料来源：北京维通利华实验动物技术有限公司。Wistar大鼠进行1 w的适应期喂养，然后开始实验。

1.2试剂及药品 牛Ⅱ型胶原(Collagen Type Ⅱ，批号：C7806)，弗氏完全佐剂(FCA，批号：F5881，美国Sigma公司)，TNF-α、IL-1β酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒(武汉华美生物工程公司，批号：CSB-E11987r、CSB-E08055r)，注射用AS2O3(哈尔滨伊达药业公司，国药准字：H20080665)；雷公藤多苷片(贵州汉方药业有限公司，国药准字：Z52020369)。

1.3仪器 电热恒温水浴锅(HW-SY11-K P2，北京市长风仪器公司)、垂直电泳槽(DYCZ-24DN，北京六一仪器厂)、冷冻离心机(LDZ5-2型,北京离心机厂)、电转仪(DYCZ-40，北京市六一仪器厂)。

1.4模型复制 参照文献方法〔5〕，建立CIA模型，造模前将胶原溶液与FCA等体积混合、乳化。将混悬乳剂0.4 ml注射于大鼠右后足跖肉垫皮内致炎，第8天以相同乳剂和剂量于大鼠尾根部加强注射。空白对照组不予任何处理。

1.5分组及给药 将60只健康清洁级Wistar 大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、雷公藤对照组及AS2O3低、中、高剂量组，每组10只。大鼠用药剂量根据人与大鼠体质量换算，雷公藤对照组每次6.25 mg/kg，1次/d灌胃给药，AS2O3低、中、高剂量组每日给药量分别为0.5、1.0、2.0 mg/kg，于造模第1天开始给药，每周1次腹腔注射；其余各组大鼠灌胃给药，空白对照组和模型对照组给予等体积生理盐水灌胃。给药 28 d 后，断头处死大鼠采血，离心取血清用于细胞因子活性测定，分离关节滑膜组织观察病理学形态改变。

1.6观察指标

1.6.1一般情况观察 分别观察各组大鼠在造模、治疗前后毛色、反应速度、精神状态、进食情况、关节肿胀情况及排泄物等变化。

1.6.2关节肿胀度 用游标卡尺测量大鼠左后肢踝关节的直径(mm)，每周测1次。以第1天测得的值为基值，之后测得的值与基值的差值即为关节肿胀度。

1.6.3关节病理观察 麻醉处死大鼠后，每组随机选取2只大鼠，取右后踝关节与滑膜组织长约2 cm制作标本，经中性甲醛固定，硝酸脱钙，常规石蜡包埋，切片，苏木素-伊红(HE)染色。光镜下观察滑膜细胞和血管的增生，淋巴细胞浸润及软骨的增生、破坏等情况。

1.6.4ELISA检测血清中IL-1β、TNF-α表达 ELISA试剂盒置于4℃冰箱中保存，使用前室温平衡30 min，严格按照试剂盒要求进行操作，最后绘制标准曲线，依据曲线方程计算各样本的浓度。

1.7统计学方法 应用SPSS22.0软件，符合正态分布和方差齐性的数据采用单因素方差分析，不符合正态分布则采用非参数检验。

2 结 果

2.1大鼠一般情况观察 空白对照组大鼠活动正常，毛色光泽，正常进食与饮水，体重逐渐增加，对各项刺激反应灵敏。模型对照组大鼠于造模12 h后开始出现踝膝关节肿胀，摄食减少；各给药组部分大鼠于造模第4天开始出现踝膝关节轻度肿胀，摄食减少；第8天所有大鼠均出现明显踝膝关节肿胀，甚者出现四肢关节肿胀，足部皮肤皲裂，跛行，毛色暗淡，活动受限，进食减少，便质变稀、不成形，精神萎靡，反应迟钝。经4 w治疗后，各给药组上述情况均有所好转，模型对照组改善不明显，模型对照组少数大鼠出现关节畸形。实验过程中，各组大鼠无死亡，可能与良好的实验室环境有关。

2.2各组大鼠关节肿胀度比较 治疗前各造模组关节肿胀度与空白对照组同一时间点相比差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后1 w模型对照组关节肿胀度开始上升，治疗后2 w达到高峰，治疗后3～4 w逐渐下降，各时间点关节肿胀度与空白对照组相比均有统计学差异(P<0.01)。治疗后1～4 w：各治疗组关节肿胀度逐渐下降，各时间点与模型对照组相比具有统计学差异(P<0.01或P<0.05)；AS2O3低、中剂量组与雷公藤对照组相比，关节肿胀度差异无统计学意义(P>0.05)；AS2O3高剂量组与雷公藤对照组相比关节肿胀度具有统计学差异(P<0.01或P<0.05)。见表1。

2.3滑膜组织病理学形态改变 空白对照组大鼠关节滑膜未见炎性细胞浸润及纤维组织增生；模型对照组滑膜组织见大量淋巴细胞、浆细胞及较多中性粒细胞浸润，并见关节软骨破坏及关节内纤维组织增生；雷公藤对照组滑膜组织局部见较多淋巴细胞、浆细胞浸润；AS2O3低剂量组滑膜组织见较多淋巴细胞、浆细胞及较多中性粒细胞浸润，关节腔内见炎性渗出物；AS2O3中剂量组部分滑膜组织见少量淋巴细胞和中性粒细胞浸润；AS2O3高剂量组近关节腔的滑膜结构较正常，其他滑膜组织内可见少量淋巴细胞浸润。见图1。

2.4ELISA检测IL-1β及TNF-α水平 与空白对照组相比，模型对照组IL-1β、TNF-α的表达升高(P<0.01)；与模型对照组相比，各治疗组IL-1β、TNF-α的表达均有不同程度下降(P<0.01)；与雷公藤对照组相比，AS2O3低、中剂量组IL-1β及TNF-α水平无统计学意义(P>0.05)，AS2O3高剂量组IL-1β及TNF-α水平优于雷公藤对照组(P<0.05)。见表2。

表1 各组大鼠治疗前后关节肿胀度比较

与空白对照组同一时间点相比：1)P<0.01；与模型对照组同一时间点相比：2)P<0.01，3)P<0.05；与雷公藤对照组同一时间点相比：4)P<0.01，5)P<0.05；下表同

图1 各组滑膜组织病理学改变(×40)

组别IL⁃1βTNF⁃α空白对照组10478±4465218±202模型对照组19364±5951)9745±3141)雷公藤对照组13395±4442)7127±3112)AS2O3低剂量组13598±4672)7354±3402)AS2O3中剂量组12913±4852)6826±3252)AS2O3高剂量组11233±4552)5)5838±3632)5)

3 讨 论

RA是一种以对称性、多关节病变为主要表现的自身免疫性疾病。NF-κB 是广泛存在于真核细胞内的重要调节蛋白，在哺乳动物细胞中最常见的是NF-κB p65与p50结合形成p65/p50二聚体。在静息状态下，胞质中NF-κB与抑制蛋白IκB结合形成复合体，并覆盖了NF-κB的核定位信号，使NF-κB锚定于胞质中，不能发挥基因转录调控功能。IκB亚基IκBα与NF-κB二聚体上的两个核定位序列中的一个结构结合，使得非活性状态的NF-κB-IκBα能够进入细胞核；同时，IκBα蛋白氨基末端的出核信号能够使NF-κB-IκBα复合物移出细胞核，NF-κB-IκBα复合物在核内与核外处于动态平衡中。正常情况下，胞核中检测不到NF-κB-IκBα复合物是因为出核过程比入核过程效率高〔6〕。由于IκBα启动子上有一个NF-κB反应元件，对刺激比较敏感，能够快速被降解与再合成〔7〕，当细胞受到TNF-α、IL-1β、T细胞激活剂、生长因子及病毒感染等外源性刺激后，可激活IKK导致IκB发生磷酸化被降解，使NF-κB异二聚体失去IκB的抑制作用而移位到细胞核内，与相关基因结合从而发挥转录调控作用。目前研究〔2〕已经证实TNF-α、IL-1β、干扰素-γ等炎性细胞因子是NF-κB信号通路中被激活的重要标志，滑膜细胞中TNF-α、IL-1β及干扰素-γ等致炎因子通过一系列级联反应，最终激活IKK复合体释放NF-κB，从而调控各种炎症基因的表达，产生的各种炎症因子与活化了的NF-κB形成了一个正相的调控循环，促进RA的炎症反应和关节破坏的发生。

AS2O3在祖国传统中医药中早有应用，是目前在临床上被较多应用的凋亡诱导剂。观察RA的发病过程，其滑膜组织增生侵袭性生长及病理学行为在许多方面类似于肿瘤组织的特性。在AS2O3抗肿瘤的研究中，促进细胞凋亡和抑制血管增生是其主要作用机制，而滑膜细胞凋亡失调和血管过度增生在RA发病过程中起到重要作用。相关研究〔8〕表明，腹腔注射AS2O3治疗CIA大鼠，可抑制炎症细胞浸润、滑膜细胞增生，有效降低CIA大鼠关节炎指数。有研究〔9〕表明，关节腔内注射AS2O3可有效改善CIA大鼠X线表现。因此，砷制剂可能诱导RA增生的滑膜细胞凋亡。

本研究结果显示，AS2O3各治疗组能够不同程度抑制CIA 大鼠关节滑膜炎症反应，其中以高剂量组最明显，低、中剂量组与雷公藤对照组作用相当，而AS2O2抗炎作用机制可能与其降低血清中炎症因子IL-1β、TNF-α 表达有关。

1Kourilovitch M,Galarzamaldonado C,Ortizprado E.Diagnosis and classification of rheumatioid arthritis〔J〕.J Autoimmun,2014;48-9(2):26-30.

2施利青,董 婷,甸自金,等.类风湿关节炎患者血清白细胞介素及肿瘤坏死因子表达的研究〔J〕.国际检验医学杂志,2015;36(23):3416-7.

3Goff BL,Singbrant S,Tonkin BA,etal.Oncostatin M acting via OSMR,augments the actions of IL-1 and TNF in synovial fibroblasts 〔J〕.Cytokine,2014;68(2):101-9.

4董 琳,权洪峰,付雪艳.抗类风湿性关节炎的天然药物及其与T细胞调控相关的作用机制研究进展〔J〕.黑龙江医药,2014;27(5):1073-4.

5Larson P.Homologous type Ⅱ collagen induced arthritis in rats〔J〕.Arthritis Rheum,1990;33(5):693-701.

6Irbaeh A,Gold P,Binder BR,etal.Signaling molecules of the NF-kappaB pathway shuttle constitutively between cytoplasm and nucleus〔J〕.J Biol Chem,2002;277(13):10842-51.

7Lee DK,Kang JE,Park HJ,etal.FBI-1 enhances transcription of the nuclear factor-kappaB(NF-kappaB)-responsive E-selectin gene by nuclear localization of the p65 subunit of NF-kappaB〔J〕.J Biol Chem,2005;280(30):27783-91.

8任丽民,张莉芸,张改连,等.腹腔注射三氧化二砷对胶原诱导关节炎大鼠血清炎性趋化因子的影响〔J〕.中华临床免疫和变态反应杂志,2015;9(4):256-61.

9李鸿江,董玉意,李拾林,等.关节腔内注射三氧化二砷对胶原诱导关节炎大鼠体重及X线评分的影响〔J〕.中国老年学杂志,2014;34(3):706-7.

Theanti-inflammatoryactionofarsenictrioxideincollageninducedarthritismodelrats

TANGFang，MAWu-Kai，CHENYu-Ting,etal.

DepartmentofRheumatologyandImmunology，No．2AffiliatedHospitalofGuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine，Guizhou550001，Guiyang,China

ObjectiveTo observe the influence of arsenic trioxide(AS2O3) on the level of serum tumor necrosis factor(TNF) -α, interleukin (IL) -1βin collagen induced arthritis (CIA) model rats.Methods60 healthy and clean Wistar rats were randomly divided into blank control,model control,tripterygium wilfordii(TwHF) control, AS2O3high, medium and low dose treatment groups,each group with 10 rats. The changes of joint pathology and arthritis index in CIA rats were observed,and the levels of serum TNF-α, IL-1β were measured.ResultsAS2O3inhibited the joint swelling,reduced the levels of serum TNF-α, IL-1β,and reduced the joint synovial cell hyperplasia and the lymphocyte infiltration in synovial layer and synovial lower layer. The curative effect in the AS2O3low and medium dose treatment groups were comparable to those of TwHF control group(P>0.05), the curative effect of high dose treatment group was better than that of TwHF control group (P<0.01).ConclusionsAS2O3could alleviate the joint swelling degree and the joint synovial lymphocyte infiltration.

Arsenic trioxide;Collagen induced arthritis;Tumor necrosis factor α;Interleukin-1β

R2-031

A

1005-9202(2017)24-6005-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.001

国家自然科学基金资助项目(81460727)；贵州省社会公关课题(黔科合SY字(2013)3048号)；国家中医药管理局重点建设专科项目(2012年)；贵州省科技创新人才团队(黔科合人才团队(2013)4033)；贵州省中医药管理局课题(QZYY2013-63)；

马武开(1968-)，男，博士，教授，主要从事风湿免疫疾病研究。

唐 芳(1978-)，女，硕士，副主任医师，主要从事风湿免疫疾病研究。

〔2017-05-16修回〕

(编辑 袁左鸣)