红景天苷对慢性缺氧小鼠学习记忆功能障碍的影响

郭天笑 刘 嵩 张 琳 刘冬雪 杨子龙 刘松熠 徐炜烨 赵行宇

(吉林医药学院应用心理学院，吉林 吉林 132013)

红景天苷对慢性缺氧小鼠学习记忆功能障碍的影响

郭天笑 刘 嵩 张 琳 刘冬雪 杨子龙 刘松熠 徐炜烨 赵行宇

(吉林医药学院应用心理学院，吉林 吉林 132013)

目的探讨红景天苷对慢性缺氧小鼠学习记忆功能障碍的影响及可能机制。方法昆明种小鼠90只，分为正常对照组、缺氧对照组及红景天苷组，每组30只，置FLY-6型低压舱内，以1 m/s速度上升至7 000 m，停留30 min，1 m/s下降至地面，停留30 min，再上升，循环往复，持续8 w制成慢性缺氧模型。红景天苷组小鼠每天灌胃给予200 mg/kg红景天苷。实验结束后，水迷宫检测各组学习记忆能力，Hoechst检测海马齿状回细胞凋亡情况，免疫组化检测海马齿状回Bcl-2、Bax蛋白表达。结果与正常对照组比较，缺氧对照组小鼠学习记忆能力明显下降，海马细胞凋亡明显增加，Bcl-2表达明显减少，Bax表达明显增加(均P<0.05)；与缺氧对照组比较，红景天苷组学习记忆能力明显增加，海马细胞凋亡明显减少，Bcl-2表达明显增加，Bax表达明显减少(均P<0.01)。结论长期慢性缺氧可以导致小鼠海马细胞凋亡，学习记忆功能下降；红景天苷可以通过调节Bcl-2及Bax蛋白表达，减少海马细胞凋亡，从而改善慢性缺氧导致的学习记忆能力下降。

慢性缺氧；学习记忆；凋亡

缺氧对人体的影响是多方面的，在急性严重的缺氧条件下，对脑认知功能的影响主要为快速的血氧下降所致的认知功能改变，而慢性缺氧主要表现为代偿作用，但无论急性还是慢性缺氧，只要到一定的严重程度，都会导致不同程度与形式的认知功能障碍〔1,2〕。反复慢性缺氧暴露，会导致智力、注意、协调及解决问题的能力明显下降〔3,4〕。一些慢性缺血、缺氧性疾病均可导致脑结构改变，特别是胶质细胞和神经元凋亡是脑功能改变的共同因素，正是这些改变导致脑认知功能改变〔5,6〕。红景天苷是藏医中重要的抗缺氧、抗疲劳药物，在吉林等高寒山区亦有分布，红景天苷中的许多提取成分都有抗缺氧功能。本文探讨红景天苷对慢性缺氧小鼠学习、记忆功能的影响。

1 材料与方法

1.1动物与分组 昆明种小鼠90只，购于吉林大学动物实验室，雌雄各半，平均体质量(21.4±2.2)g，在本实验室适应性饲养1 w后，随机分为正常对照组、缺氧对照组和红景天苷组，每组30只。

1.2药品与试剂 红景天苷(哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心，红景天苷质量分数为58.75%)；Hoechst、Bcl-2、Bax抗体购于碧云天生物有限公司，Morris水迷宫由成都泰盟科技有限公司生产，FLY-6低压氧舱由成都风雷科技责任有限公司生产。

1.3实验方法 正常对照组小鼠在低压舱旁饲养，缺氧对照组和红景天苷组置于低压舱中，以1 m/s上升至7 000 m，停留30 min后，以1 m/s下降至地面，停留30 min再上升，如此循环，连续8 w；红景天苷组每天每公斤体重灌胃给予红景天苷200 mg，其他组给予等量体积生理盐水。实验结束时，进行水迷宫训练，训练时，每只小鼠在同一点入水2次，找到平台后，休息30 s，进行下一次训练，120 s内找不到平台，引导上平台，休息30 s，进行下一次训练，记录小鼠逃避潜伏期。5 d后，进行定位航行实验，撤去平台，分别记录从4个象限入水，游泳60 s，记录经过有效区平均停留时间。

1.4免疫组化检测海马组织Bcl-2、Bax蛋白的表达 每组取2只小鼠，乙醚麻醉，开胸，暴露心脏，剪开左心室插入灌注针头至升主动脉，用止血钳固定，快速灌注100～150 ml预冷的生理盐水(4℃)，待右心耳鼓涨，呈球状，剪开右心耳，血液冲洗干净后，灌注4%多聚甲醛(4℃)500 ml。先快后慢，持续约2 h。 断头取小鼠脑组织，置入同浓度多聚甲醛溶液中浸泡固定10 h，常规石蜡包埋及组织切片，片厚5 μm。免疫组化观察海马组织Bcl-2、Bax的表达。

1.5Hoechst荧光检测海马细胞凋亡 用 Hoechst 33258染色后，在荧光显微镜下观察，正常细胞核呈蓝色，凋亡细胞的胞核呈致密浓染或碎块状致密浓染，颜色发白。

1.6统计学方法 采用SPSS13.0 统计软件进行t检验。

2 结 果

2.1小鼠学习记忆功能的改变 与正常对照组比较，缺氧对照组逃避潜伏期明显延长(P<0.05)，平均有效区停留时间减小(P<0.01)；红景天苷组逃避潜伏期延长，但不显著，平均有效区停留时间明显减小(P<0.05)。与缺氧对照组比较，红景天苷组逃避潜伏期有下降，但不显著，平均有效区停留时间有延长(P<0.05)。见表1。

2.2各组海马组织Bcl-2、Bax的表达 各组海马齿状回细胞Bcl-2蛋白表达见图1，其中棕色颗粒为阳性染色颗粒，缺氧后颗粒量明显减少，使用红景天苷后，染色有所增加；Bax蛋白表达见图2，缺氧后，染色明显加深，红景天苷干预后，染色变浅。各组平均光密度值(OD值)见表2。与正常对照组相比，缺氧对照组Bcl-2 OD值明显降低(P<0.01)，红景天苷组明显高于缺氧对照组(P<0.05)，但明显低于正常对照组(P<0.05)；缺氧对照组Bax明显高于正常对照组(P<0.01)，红景天苷组Bax明显高于正常对照组(P<0.05)，但明显低于缺氧对照组(P<0.05)。与正常对照组相比，缺氧对照组Bcl-2/Bax比值明显降低(P<0.01)，红景天苷组明显高于缺氧对照组(P<0.01)，但明显低于正常对照组(P<0.01)。

2.3各组海马组织细胞凋亡情况(Hoechst荧光染色法) 图3可见，正常对照组染色浅，呈淡蓝色，缺氧对照组细胞核颜色发白边缘不规则，细胞核染色体浓集，并伴有细胞核固缩和细胞核碎片增加的现象，为细胞发生凋亡的典型特征。给予红景天苷组颜色有所下降，上述凋亡现象减弱，渐呈淡蓝色。

表1 各组小鼠逃避潜伏期与平均有效停留时间

与正常对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与缺氧对照组比较：3)P<0.05，4)P<0.01，下表同

图1 各组海马齿状回Bcl-2表达(DAB，×400)

图2 各组海马齿状回Bax表达(DAB，×400)

组别Bcl⁃2BaxBcl⁃2/Bax正常对照组0542±00620386±00534)1496±0184缺氧对照组0361±00702)0460±00582)0795±01902)红景天苷组0410±00571)3)0409±00571)3)1022±01692)4)

图3 小鼠海马齿状回核荧光染色镜下观察(Hoechst染色法，×400)

3 讨 论

慢性缺血缺氧性疾病在临床多种疾病中都可出现，由于长期较强程度的缺氧，神经细胞会由于能量代谢等变化诱发神经细胞变性、凋亡甚至出现纤维缠结。细胞凋亡是组织结构改建的步骤之一，为机体生长不可或缺的条件，同时细胞凋亡也为细胞受损后提供了一种比坏死更有效减弱损伤对机体作用的方式，是由损伤因素启动的一系列细胞内生化反应过程，也是一个主动耗能的过程，为细胞内凋亡程序所控制。Bcl-2基因与凋亡的关系密切，对线粒体膜完整性具有保护作用，可能是此基因抗凋亡作用的主要机制。Bcl-2的表达水平可反映海马细胞的凋亡情况，研究发现针对缺血缺氧损伤的药物可使机体细胞Bcl-2表达上升，细胞凋亡减少〔7,8〕。 本研究显示缺氧后Bax表达增加，Bcl-2表达下降，说明海马细胞的凋亡与该变化有关，凋亡相关蛋白在慢性缺氧小鼠的海马细胞凋亡中起到了重要的作用。缺氧后，细胞能量产生障碍，并引起中性蛋白酶活性的病理性增加，可使细胞膜结构分解，细胞骨架破坏导致细胞死亡〔9～13〕。研究表明红景天苷具有抗缺氧的作用〔14,15〕。本实验提示红景天苷抑制缺氧后海马细胞凋亡的可能机制是使Bcl-2的表达增加，Bax的表达下降，从而抑制细胞的凋亡，保护海马细胞。

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R395;R285

A

1005-9202(2017)24-6029-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.011

吉林省科技厅科技发展项目(No.20130101157JC)；吉林省教育厅“十一五”科学技术研究项目(No.2010-255)；吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目(No.2014-363)

赵行宇(1970-)，男，副教授，主要从事生理心理学研究。

郭天笑(1987-)，男，硕士，助教，主要从事思想政治教育、心理健康教育研究。

〔2016-03-24修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)