脂肪酸结合蛋白4基因启动子 rs77878271多态性与颈动脉粥样硬化的关系研究

焦荣红，于明月，张明明，牛慧敏，刘 欣

脂肪酸结合蛋白4基因启动子rs77878271多态性与颈动脉粥样硬化的关系研究

焦荣红1，于明月1，张明明2，牛慧敏1，刘 欣1

目的探究脂肪酸结合蛋白4(FABP4)基因启动子rs77878271多态性与颈动脉粥样硬化的关系。方法选取2013年10月—2014年9月在河北省人民医院就诊的颈动脉粥样硬化患者580例，采用TaqMan SNP基因分型技术检测rs77878271多态性；采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测FABP4 mRNA相对表达量，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测FABP4蛋白。rs77878271基因型与颈动脉中层内膜厚度(IMT)的关系分析采用多元线性回归分析，与颈动脉斑块的关系分析采用多因素Logistic回归分析。结果本组患者中携带TT基因型者占88.6%(514/580)、携带TC基因型者占10.0%(58/514)、携带CC基因型者占1.4%(8/58)。不同rs77878271基因型患者随访期间心血管事件发生率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。不同rs77878271基因型患者男性比例、年龄、吸烟率、肥胖发生率、高血压发生率、糖尿病发生率、使用降压药物者所占比例、使用降糖药物者所占比例、使用降脂药物者所占比例、使用抗栓药物者所占比例及总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、三酰甘油(TG)、空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(INS)、C反应蛋白(CRP)水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；不同rs77878271基因型患者体质指数(BMI)、IMT、颈动脉斑块者所占比例及低密度脂蛋白(LDL)水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。多元线性回归分析结果显示，rs77878271基因型与颈动脉粥样硬化患者颈动脉IMT有关(β=0.23，P<0.05)；多因素Logistic回归分析结果显示，rs77878271基因型是颈动脉粥样硬化患者颈动脉斑块的影响因素〔OR=3.02,95%CI(1.46,7.97),P<0.05〕。TC基因型患者FABP4 mRNA相对表达量和蛋白相对表达量均低于CC基因型患者(P<0.05)。结论FABP4基因启动子rs77878271多态性与颈动脉粥样硬化程度有关。

颈动脉硬化；脂肪酸结合蛋白4；rs77878271；多态性,单核苷酸

脂肪酸结合蛋白4(fatty acid-binding protein 4，FABP4)是脂肪细胞和巨噬细胞中表达水平较高的一种脂质分子伴侣，可调节机体新陈代谢、炎症并促进动脉粥样硬化的发生发展[1- 2]。FABP4基因是定位于8q21的单拷贝基因，含4个外显子和3个内含子。董美玲等[3]研究结果显示，FABP4基因第四号外显子上的单核苷酸多态位点rs1054135与儿童肥胖无关，但rs16909187、rs16909196多态性与女性青少年肥胖有关。动物实验结果显示，FABP4基因缺陷或口服FABP4小分子抑制剂可有效抑制动脉粥样硬化进展[4-5]、改善肥胖相关代谢紊乱及降低2型糖尿病发生率[6]。人类FABP4基因启动子rs77878271 (T-87C)多态性破坏了CAAT盒子/增强子结合蛋白α结合序列，导致体外和体内脂肪组织中FABP4基因转录降低，且FABP4变异体低表达降低了冠心病发病风险[7]。本研究旨在探讨FABP4基因启动子rs77878271多态性与颈动脉粥样硬化的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年10月—2014年9月在河北省人民医院就诊的颈动脉粥样硬化患者580例，均经颈动脉超声检查或数字减影血管造影确诊。纳入标准：年龄≥30岁。排除标准：(1)合并颈动脉畸形、颈动脉瘤、动脉炎、自身免疫系统疾病、肿瘤、血液系统疾病、肝肾功能不全及慢性炎性疾病者；(2)近30 d内有输血史者。本研究经医院医学伦理委员会审核批准，所有患者知情同意并签署知情同意书。

1.2 观察指标 分析所有患者的临床特征，包括性别、年龄、体质指数(BMI)、心血管危险因素、颈动脉中层内膜厚度(IMT)、颈动脉斑块、药物使用情况及实验室检查指标。心血管危险因素包括吸烟、肥胖(BMI≥28.0 kg/m2)、高血压、糖尿病；采用彩色多普勒超声诊断仪检测颈动脉IMT，其中颈动脉IMT≥1.2 mm定义为颈动脉斑块；药物使用情况包括降压药物、降糖药物、降脂药物及抗栓药物使用情况；实验室检查指标包括总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、三酰甘油(TG)、空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(INS)及C反应蛋白(CRP)。

1.3 随访 所有患者进行电话随访，随访截至2016年9月。记录患者随访期间心血管事件发生情况，包括死亡、缺血性卒中、短暂性脑缺血发作(TIA)、心肌梗死及冠心病等。

1.4 基因分型 采集所有患者全血2 ml，采用苯酚-氯仿法提取基因组DNA，通过TaqMan SNP基因分型技术检测FABP4基因启动子rs77878271多态性。PCR反应体系为5 μl，包括模板10 ng，2×TaqMan PCR MasterMix 2.5 μl、20×SNP Assay 0.25 μl。反应条件为95 ℃ 10 min；(92 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min)×40个循环。聚合酶链反应(PCR反应)和荧光信号读取均在ABI7900HT Sequence Detector上完成，采用SDS 2.0图像分析软件进行终点分析，通过检查不同等位基因所标记的荧光强度判断待测样本基因型。

1.5 FABP4 mRNA和蛋白检测方法 切除患者整块颈动脉粥样硬化组织，0.9%氯化钠溶液冲洗，取一小块组织剪碎后加入1 ml TRIzol不断研磨，待组织细胞溶解后转移至1.5 ml Eppendorf管中。使用氯仿-异戊醇法提取RNA，使用PrimeScript®RT试剂盒将RNA反转录为cDNA。使用SYBR Green荧光染料作为检测信号，在FTC-3000 qPCR仪上进行扩增,采用相对定量法(2-△△CT)分析FABP4 mRNA相对表达量。另取一小块组织剪碎后加入1 ml RIPA裂解液(含1 mM PMSF)研磨，充分裂解细胞后，将液体转移至无菌Eppendorf管中。采用人FABP4酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测FABP4蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 不同rs77878271基因型患者心血管事件发生率比较 本组患者中携带TT基因型者占88.6%(514/580)、携带TC基因型者占10.0%(58/514)、携带CC基因型者占1.4%(8/58)。随访期间，携带TT基因型者心血管事件发生率为31.7%(163/514)，携带TC基因型者为34.5%(20/58)，携带CC基因型者为12.5%(1/8)；不同rs77878271基因型患者随访期间心血管事件发生率比较，差异无统计学意义(χ2=3.924，P=0.140，见表1)。

表1 不同rs77878271基因型患者心血管事件发生情况(例)

Table1 Incidence of cardiovascular events in patients with different rs77878271 genotypes

rs77878271基因型例数缺血性卒中TIA心肌梗死冠心病TT51428403857TC582433CC80001

注：TIA=短暂性脑缺血发作

2.2 不同rs77878271基因型患者临床特征比较 不同rs77878271基因型患者男性比例、年龄、吸烟率、肥胖发生率、高血压发生率、糖尿病发生率、使用降压药物者所占比例、使用降糖药物者所占比例、使用降脂药物者所占比例、使用抗栓药物者所占比例及TC、HDL、TG、FBG、INS、CRP水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；不同rs77878271基因型患者BMI、颈动脉IMT、颈动脉斑块者所占比例及LDL水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05，见表2)。

表2 不同rs77878271基因型患者临床特征比较

注：BMI=体质指数，IMT=内膜中层厚度，TC=总胆固醇，HDL=高密度脂蛋白，LDL=低密度脂蛋白，TG=三酰甘油，FBG=空腹血糖，INS=空腹胰岛素，CRP=C反应蛋白；a为χ2值

2.3 颈动脉粥样硬化患者颈动脉IMT的影响因素分析 多元线性回归分析结果显示，rs77878271基因型与颈动脉粥样硬化患者颈动脉IMT有关(P<0.05，见表3)。

表3 颈动脉粥样硬化患者颈动脉IMT影响因素的多元线性回归分析

Table3 Multivariate linear regression analysis on influencing factors of carotid IMT in carotid atherosclerotic patients

变量βSEt值P值年龄0 330 390 860 41性别0 370 390 530 57BMI-0 520 39-0 090 93使用降脂药物0 340 111 510 16rs77878271基因型0 230 073 260 03

2.4 颈动脉粥样硬化患者颈动脉斑块的影响因素分析 将年龄(赋值：<65岁=0，≥65岁=1)、性别(赋值：女性=0，男性=1)、肥胖(赋值：否=0，是=1)、使用降脂药物(赋值：无=0，有=1)、rs77878271基因型(赋值：CC=0，TC/TT=1)作为自变量，将颈动脉斑块(赋值：无=0，有=1)作为因变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示，rs77878271基因型是颈动脉粥样硬化患者颈动脉斑块的影响因素(P<0.05，见表4)。

表4 颈动脉粥样硬化患者颈动脉斑块影响因素的多因素Logistic回归分析

Table4 Multivariate Logistic analysis on influencing factors of carotid plaques in carotid atherosclerotic patients

变量βSEWaldχ2值dfP值OR(95%CI)年龄0 390 110 4810 551 43(0 55，3 11)性别0 430 070 5510 591 57(0 82，2 55)BMI0 750 881 5110 211 18(0 45，2 12)降脂药物0 891 233 3410 071 781(0 73，4 32)rs77878271基因型1 611 534 0910 023 02(1 46，7 97)

2.5 不同rs77878271基因型患者FABP4 mRNA和蛋白相对表达量比较 以携带TT基因型患者FABP4 mRNA和蛋白相对表达量作为1，携带TC基因型患者mRNA和蛋白相对表达量均低于携带CC基因型患者，差异有统计学意义(P<0.05，见表5)。

Table5 Comparison of relative expression quality of FABP4 mRNA and protein in patients with different rs77878271 genotypes

基因型例数mRNA相对表达量蛋白相对表达量TC580 31±0 070 33±0 05CC80 84±0 100 75±0 11t值6 653 27P值0 010 03

3 讨论

FABP4主要表达于脂肪细胞和巨噬细胞，是脂肪酸的转运蛋白，可影响脂肪酸代谢及脂肪酸信号传导，与动脉粥样硬化密切相关。既往研究结果显示，颈动脉斑块中FABP4高表达与卒中发生有关[8]，分析其机制可能如下：FABP4激活未折叠蛋白应答(UPR)信号通路[4]，导致血管壁巨噬细胞中的游离胆固醇进入内质网，进而增加内质网应激并扰乱其功能[6]，导致无法修复的细胞凋亡[9- 10]。动物实验结果显示，2周龄载脂蛋白E缺陷小鼠经致死性放射后，分别移植FABP4突变和缺陷型小鼠的骨髓，结果显示，正常饮食喂养13周后移植FABP4缺陷型骨髓的小鼠动脉粥样硬化斑块体积明显缩小[11]；小鼠口服FABP4小分子抑制剂可防止动脉粥样硬化发生发展及血管病变发生[12]，提示FABP4可能具有促动脉粥样硬化作用。虽然FABP4缺乏抗动脉粥样硬化机制已在动物实验中证实，但FABP4基因启动子rs77878271多态性与人类动脉粥样硬化的关系尚需进一步研究。本研究结果显示，不同rs77878271基因型患者随访期间心血管事件发生率间无差异，分析其原因可能与本研究随访时间短及纳入的部分患者较年轻有关。

颈动脉IMT增加是亚临床动脉粥样硬化的临床标志，其与心肌梗死和卒中发生风险升高有关[12]。既往研究结果显示，小鼠FABP4基因缺陷可改善脂质代谢、保护胰腺β细胞，进而预防肥胖诱导的胰岛素抵抗和2型糖尿病[13-14]。本研究结果显示，rs77878271基因型与颈动脉粥样硬化患者颈动脉IMT有关，且rs77878271基因型是颈动脉粥样硬化患者颈动脉斑块的影响因素，提示rs77878271基因型与颈动脉粥样硬化程度有关。

综上所述，FABP4基因启动子rs77878271多态性与颈动脉粥样硬化程度有关，FABP4可能成为动脉粥样硬化新的治疗靶点。

作者贡献：焦荣红进行文章的构思与设计，研究的实施与可行性分析，撰写论文，负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责，监督管理；于明月、张明明、刘欣进行数据收集、整理、分析；牛慧敏进行结果分析与解释；于明月、刘欣进行论文及英文的修订。

本文无利益冲突。

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RelationshipbetweenFABP4GenePromoterrs77878271PolymorphismandCarotidAtherosclerosis

JIAORong-hong1，YUMing-yue1，ZHANGMing-ming2，NIUHui-min1，LIUXin1

1.DepartmentofUltrasonography，thePeople′sHospitalofHebeiProvince，Shijiazhuang050051，China2.ClinicalLaboratory，thePeople′sHospitalofHebeiProvince，Shijiazhuang050051，China

ObjectiveTo investigate the relationship between FABP4 gene promoter rs77878271 polymorphism and carotid atherosclerosis.MethodsA total of 580 patients with carotid atherosclerosis were selected in the People′s Hospital of Hebei Province，TaqMan SNP genotyping technique was used to detect the FABP4 gene promoter rs77878271 polymorphism；real-time fluorescence quantitative PCR was used to detected the relative expression quantity of FABP4 mRNA，enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the relative expression quantity of FABP4 protein.Multivariate linear regression analysis was used to analyze the influencing factors of carotid IMT，meanwhile multivariate Logistic regression analysis was used to analyze the influencing factors of carotid plaques.ResultsOf the 580 patients，514 cases were TT genetype(accounting for 88.6%)，58 cases were TC genetype(accounting for 10.0%)，8 cases were CC genetype(accounting for 1.4%).No statistically significant differences of incidence of diovascular events was found in patients with different genetypes of FABP4 gene promoter rs77878271 during the follow-up(P>0.05).No statistically significant differences of male proportion，age，smoking rate，incidence of fat，hypertension or diabetes，proportion of patients using antihypertensive drugs，antidiabetic drugs，lipid-lowering drugs or antithrombotic drugs，TC，HDL，TG，FBG，INS or CRP was found in patients with different genetypes of FABP4 gene promoter rs77878271(P>0.05)，while there were statistically significant differences of BMI，carotid IMT，proportion of patients with carotid plaques and LDL in patients with different genetypes of FABP4 gene promoter rs77878271(P<0.05).Multivariate linear regression analysis results showed that，genetypes of FABP4 gene promoter rs77878271 was significantly correlated with carotid IMT in patients with carotid atherosclerosis(β=0.23，P<0.05)；multivariate Logistic regression analysis results showed that，genetypes of FABP4 gene promoter rs77878271 was one of influencing factors of carotid plaques in patients with carotid atherosclerosis〔OR=3.02，95%CI(1.46，7.97)，P<0.05〕.Relative expression quantity of FABP4 mRNA and protein in patients with TC genetypes were statistically significantly lower than those in patients with CC genetypes(P<0.05).ConclusionFABP4 gene promoter rs77878271 polymorphism is significantly correlated with carotid atherosclerosis.

Carotid atherosclerosis；Fatty acid-binding protein 4；rs77878271；Polymorphism，single

河北省重点课题计划项目(20150137)

1.050051河北省石家庄市，河北省人民医院超声科

2.050051河北省石家庄市，河北省人民医院检验科

R 543.4

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2017.11.012

焦荣红，于明月，张明明，等.脂肪酸结合蛋白4基因启动子 rs77878271多态性与颈动脉粥样硬化的关系研究[J].实用心脑肺血管病杂志，2017，25(11)：46-50.[www.syxnf.net]

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2017-09-21；

2017-11-20)

谢武英)