抑癌基因DKK3对皮肤恶性黑素瘤细胞增殖和凋亡的影响

李晶 余音 刘林红 黎智 刁庆春 王开振 肖亮 刘素桃

400011重庆市中医院皮肤科（李晶、余音、刘林红、黎智、刁庆春、刘素桃），肾病科（王开振）；湖北省十堰市人民医院骨科（肖亮）

·论著·

抑癌基因DKK3对皮肤恶性黑素瘤细胞增殖和凋亡的影响

李晶 余音 刘林红 黎智 刁庆春 王开振 肖亮 刘素桃

400011重庆市中医院皮肤科（李晶、余音、刘林红、黎智、刁庆春、刘素桃），肾病科（王开振）；湖北省十堰市人民医院骨科（肖亮）

目的探讨DKK3在人皮肤恶性黑素瘤细胞及组织中的表达及其对黑素瘤细胞A375增殖与凋亡的影响。方法通过反转录（RT）⁃PCR及实时定量PCR分析DKK3 mRNA在人恶性黑素瘤细胞系HM、A375、WM451、WM35、SK⁃MEL⁃1、Hs⁃695T和MDA⁃MB⁃435s及38例原发性黑素瘤、4例转移性黑素瘤和20例色素痣组织中的相对表达。分别转染恶性黑素瘤A375细胞pcDNA3.1（+）⁃Flag⁃DKK3质粒（实验组）和pcDNA3.1（+）⁃Flag⁃Vector质粒（对照组），RT⁃PCR 验证 DKK3的过表达；通过CCK8法和平板克隆实验分析DKK3对A375细胞增殖的影响，流式细胞仪分析DKK3对A375细胞凋亡的影响，Western印迹检测A375细胞周期和凋亡相关蛋白的表达。结果DKK3 mRNA在WM35细胞系表达下调，HM、A375、WM451、SK⁃MEL⁃1和Hs⁃695T细胞系表达缺失，MDA⁃MB⁃435s细胞高表达。与色素痣相比，DKK3 mRNA在人恶性黑素瘤组织表达降低（P＜0.001）。与对照组A375细胞相比（100%），实验组A375细胞克隆形成效率明显受到抑制（23.22%±3.55%）；同时转染后24、48、72 h细胞活性受到明显抑制（均P＜0.05）。流式细胞仪检测发现，与对照组A375细胞（G1期，25.38%±2.92%）相比，实验组A375细胞明显阻滞于G1期（48.68%±3.92%，P＜0.001），细胞凋亡率明显升高（P＜0.001）。与对照组A375细胞相比，实验组周期凋亡相关蛋白p21、Bax、活化的parp和活化的Caspase⁃3表达升高，细胞周期蛋白D1和Bcl2表达降低（均P＜0.001）。结论DKK3在人皮肤恶性黑素瘤组织中表达下调，可能作为潜在的抑癌基因参与皮肤恶性黑素瘤的进展。

黑色素瘤；细胞增殖；细胞凋亡；DKK3；抑癌基因

全球肿瘤癌症数据统计显示，发达国家中，皮肤恶性黑素瘤在所有肿瘤中的发病率高居第8位［1］。皮肤恶性黑素瘤的病因目前尚不完全清楚，可能与紫外线照射、种族、遗传、化学致癌物、病毒等因素相关。寻找新的肿瘤相关靶基因有着重要意义［2］。DKK3（dickkopf⁃related protein 3）基因是分泌性肿瘤抑癌基因，在人胃癌［3］、结肠癌［3］、肾癌［4］、乳腺癌［5］等多种肿瘤中发挥重要作用，但DKK3在人皮肤黑素瘤中的作用尚未见报道。我们检测DKK3基因在恶性黑素瘤组织和细胞系中的表达，并过表达黑素瘤细胞A375中DKK3基因，分析过表达后细胞增殖、周期及凋亡变化。

资料与方法

一、临床资料

2014年8月至2016年8月收集重庆市中医院皮肤科42例黑素瘤（包括38例原发性黑素瘤和4例转移性黑素瘤）和20例色素痣组织标本。黑素瘤患者中，24例（57.1%）＞50岁，18例（42.9%）＜50岁；男23例（54.8%），女19例（45.2%）；25例（59.5%）病变位于头和躯干，17例（40.5%）位于四肢；肢端雀斑样痣型20例，浅表扩散型3例，结节型8例，黏膜型11例；病理分期TNMⅠ+Ⅱ28例占66.7%，Ⅲ期14例占33.3%。色素痣患者中，12例（60%）＞50岁，8例（40%）＜50岁；男13例（65%），女7例（35%）。黑素瘤与色素痣患者的性别和年龄比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。本研究通过重庆市中医院医学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。所有皮肤恶性黑素瘤和色素痣病例均经本院病理科确诊。

二、试剂和仪器

膜联蛋白V-荧光素探针/碘化丙锭（Annexin V⁃FITC/PI）凋亡试剂盒来自上海翊圣生物科技有限公司，CCK8细胞增殖试剂盒来自美国Promega公司，RNA提取试剂盒来自美国Life Technologies公司，反转录试剂盒来自美国Promega公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。实时定量PCR（qRT⁃PCR）染料SYBR®Green产自北京诺博莱德科技有限公司。一抗、二抗抗体均来自美国Abcam公司，一抗为鼠抗人DKK3、细胞周期蛋白 D1（cyclinD1）、p21、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved⁃Caspase⁃3）、Bax、活化的PARP降解产物（cleaved⁃parp）、Bcl2单克隆或多克隆抗体，二抗为山羊抗鼠IgG抗体，内参是β肌动蛋白。人恶性黑素瘤细胞系HM、A375、WM451、WM35、SK⁃MEL⁃1、Hs⁃695T和MDA⁃MB⁃435s来自美国ATCC细胞库。

三、方法

1.DKK3过表达载体构建和细胞转染：DKK3过表达质粒及对照空载体来自广州复能基因公司。细胞转染步骤同文献［5］：将A375细胞种植在6孔板中，以Lipofectamine⁃2000（美国Invitrogen公司）为载体，转染pcDNA3.1（+）⁃Flag⁃DKK3质粒（实验组）和对照空质粒（5 μg/孔，对照组），48 h后收集细胞进行相应功能实验。

2.RNA和蛋白提取：RNA提取试剂盒提取细胞及组织RNA。细胞蛋白提取步骤同文献［5］，采用BCA测蛋白浓度。所提取的组织样本检测浓度后置于-80℃保存。

3.反转录（RT）⁃PCR检测DKK3 mRNA表达：步骤同文献［3］。总反应体系10 μl，cDNA为1 μg，目的基因扩增32个循环，以GAPDH为内参照，反应23个循环。DKK3引物序列：正向5′⁃CACCCTCAAT GAGATGTTCC⁃3′，反向5′⁃TGGTCTCATTGTGATAG CTG⁃3′。反应结束后，将产物电泳，根据电泳条带亮度评估目的基因相对表达量。

4.qRT⁃PCR检测DKK3 mRNA：步骤同文献［2］。使用HT7500生物系统以及SYBR®Green试剂盒。DKK3正向引物：5′⁃AGGCAGAAGAAGCTGC TGCTAA⁃3′，反向引物：5′⁃AGCTGGTCTCCACAGCA CTCACT⁃3′。以2⁃ΔΔCt值表示DKK3 mRNA表达水平。

5.CCK8法和平板克隆实验：CCK8实验步骤为细胞转染48 h后，计数实验组与对照组细胞，以2 000个细胞/孔的密度加入96孔板中，放于37℃、5%CO2孵箱中继续培养，细胞贴壁后0、24、48、72 h分别更换为100 μl完全培养基，同时每孔加入10 μl CCK8试剂，培养2 h，用酶标仪测定450 nm处吸光度（A值），统计作图。平板克隆实验：将实验组和对照组细胞消化离心后计数，按照每孔300、600、900个细胞的浓度梯度将细胞接种于六孔板中，并分别加入含有G418的培养液进行培养；1～2周后形成明显的细胞集落，多聚甲醛固定、染色后在显微镜下细胞克隆（以50个细胞作为克隆标准），计算实验组和对照组的细胞克隆比值，统计作图。

6.流式细胞仪分析细胞周期和凋亡率：参考文献［2］。细胞转染48 h后，①收集细胞固定24 h，PI染色后用流式细胞仪分析细胞周期；②收集细胞，结合缓冲液重悬，分别加入V-荧光素探针和PI混匀，避光30 min，用流式细胞仪分析细胞凋亡，根据早期凋亡和晚期凋亡细胞总数计算凋亡率。

7.Western印迹检测周期和凋亡相关蛋白表达：细胞转染48 h后收集细胞，提取蛋白质，凝胶电泳转膜，用含5%脱脂牛奶的PBST室温下封闭1.5 h，分别加入抗 DKK3、cyclinD1、p21、cleaved⁃Caspase⁃3、Bax、cleaved⁃parp、Bcl2及β肌动蛋白的一抗，于4 ℃摇床封闭过夜。第2天常温下复温30 min后，PBST液洗膜，加入封闭液稀释（1∶2 000）的二抗，室温下孵育2 h，显色剂显色，Fusion Advance成像仪曝光，Quantity One软件分析蛋白灰度值，以目的蛋白与β肌动蛋白条带灰度值之比表示相对表达水平。

四、统计处理

用SPSSl3.0统计软件进行分析，各实验独立重复3次，计量资料以±s表示。两独立样本间比较采用双侧t检验；多组数据的比较采用方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、DKK3 mRNA在恶性黑素瘤细胞系中的表达

RT-PCR显示，与色素痣组织相比，DKK3 mRNA在WM35细胞系表达下调，HM、A375、WM451、SK⁃MEL⁃1和Hs⁃695T细胞系表达缺失，MDA⁃MB⁃435s细胞高表达。qRT⁃PCR显示，与良性皮肤色素痣相比，DKK3 mRNA在人恶性黑素瘤细胞系中表达下调，差异有统计学意义（P＜0.001），与RT⁃PCR的结果一致。见图1。

图1 DKK3 mRNA在人恶性黑素瘤细胞系中的表达 1A：反转录PCR显示DKK3 mRNA在大部分人黑素瘤细胞系中低表达，在色素痣中高表达。1：标准参照物；2：HM；3：A375；4：WM451；5：WM35；6：SK⁃MEL⁃1；7；hS⁃695T；8：MDA⁃MB⁃435s；9、10：色素痣组织标本；1B：实时定量PCR显示DKK3 mRNA在大部分人黑素瘤细胞系表达下调。a：与色素痣比，P＜0.001

二、DKK3 mRNA在人恶性黑素瘤组织中的表达

与色素痣（1）相比，DKK3 mRNA表达水平在人恶性黑素瘤组织中显著减低（0.312 3±0.038 9，t=2.45，P＜0.001）。

三、过表达DKK3基因抑制细胞增殖

RT-PCR证实DKK3在实验组A375细胞中过表达（图2A）。CCK8实验发现，A375细胞转染24、48和72 h后，实验组细胞存活率显著下降（图2B）。同时平板克隆实验显示，与对照组（100%）相比，实验组A375细胞克隆形成效率（23.22%±3.55%，t=1.75，P＜ 0.001，图2C）下降。

四、过表达DKK3基因导致A375细胞周期停滞在G0/G1期并诱导细胞凋亡

流式细胞仪检测显示，A375细胞过表达DKK3后，细胞出现G0/G1期阻滞，与对照组（25.38%±2.92%）相比，实验组G1期细胞比例为48.68%±3.92%，差异有统计学意义（图 3，t=1.96，P＜0.001）。对照组凋亡细胞比例为14.26%±3.41%，实验组为30.22%±4.89%，差异有统计学意义（图4，t=2.1，P＜0.001）。

五、DKK3抑制和促进A375细胞周期和凋亡相关蛋白的表达

与对照组相比，实验组过表达DKK3后，cyclinD1和Bcl2表达下调，而p21、Bax、cleaved⁃parp和cleaved⁃casp3表达上调，差异均有统计学意义（P＜0.001）。见图5。

图2 过表达DKK3抑制黑素瘤细胞A375增殖 2A：RT⁃PCR示DKK3在实验组A375细胞中过表达；2B：CCK8实验显示，DKK3抑制细胞活性；2C：克隆形成实验显示，过表达DKK3抑制细胞增殖

图3 DKK3过表达后A375细胞阻滞于G1期 3A：对照组；3B：实验组

图4 DKK3过表达促进A375细胞凋亡 4A：对照组；4B：实验组

讨 论

wnt信号通路在细胞增殖、分化、免疫、器官形成等病理生理过程中起重要作用，而wnt信号的异常激活可导致肿瘤发生。DKK3作为wnt信号通路中的负调控因子在多种肿瘤中低表达，作为抑癌基因在肿瘤的增殖、凋亡、迁移中起着重要作用［5⁃7］。目前没有发现正常的永分化黑素细胞，因此在大量基础研究中，常常以正常色素痣组织作为阳性对照［2⁃5］。我们用qRT⁃PCR检测发现，色素痣DKK3表达明显高于皮肤恶性黑素瘤。RT⁃PCR检测发现，黑素瘤细胞系DKK3表达广泛缺失或下调，而在色素痣中高表达。因此，DKK3在皮肤恶性黑素瘤中表达下调，可能作为抑癌基因参与皮肤恶性黑素瘤的进展。

图5 DKK3过表达对黑素瘤375细胞周期和凋亡相关蛋白表达的影响 5A：Western印迹；5B：定量分析各蛋白表达水平。a：两组间比较，P＜0.001。cyclinD1：细胞周期蛋白 D1；cleaved⁃Caspase⁃3：活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；cleaved⁃parp：活化的PARP降解产物

为进一步确定DKK3是否作为功能性的抑癌基因参与皮肤恶性黑素瘤进展，我们检测DKK3对恶性黑素瘤细胞增殖和凋亡的影响。CCK8实验发现，转染 pcDNA3.1（+）⁃Flag⁃DKK3质粒后，A375细胞在24、48、72 h的细胞活性明显低于对照组；同时平板克隆形成实验发现，过表达DKK3能够明显抑制A375细胞的集落形成。过表达DKK3后A375细胞周期明显阻滞于G1期，细胞凋亡明显增加。因此，DKK3可能通过阻滞细胞周期和促进细胞凋亡参与恶性黑素瘤的进展，与文献［5］报道一致。Western印迹检测发现，过表达DKK3后A375细胞周期相关蛋白cyclinD1表达被抑制，p21表达上调；而细胞凋亡相关蛋白Bax和cleaved⁃casp3表达上调。p21表达与非小细胞肺癌浸润进展有关［8⁃10］，其表达缺失与cyclinD1、CDK4的过表达在胰腺癌的发生发展中起协同作用［11］。Bax和Bcl2表达与肿瘤的凋亡密切相关，Katkoori等［12］发现，Bax表达阳性结肠直肠癌患者较阴性患者预后好；在未治疗的患者中，Bax表达阳性患者的生存期是阴性患者的5倍。Caspase活化是细胞凋亡的重要标志［13］。本实验中，过表达DKK3基因后，A375细胞p21上调，cyclinD1下调，因而促进细胞周期阻滞；而Bax上调，Bcl2下调，因而促进细胞周期凋亡，最终抑制肿瘤增殖。

综上所述，DKK3在人黑素瘤组织中表达下调，过表达DKK3能够明显抑制恶性黑素瘤细胞增殖，同时促进细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡。但DKK3在组织中的甲基化现象及与表达的关系，以及DKK3基因对恶性黑素瘤细胞迁移和侵袭的影响和相关分子机制尚需进一步研究。

［1］Siegel RL,Miller KD,Jemal A.Cancer statistics,2017［J］.CA Cancer J Clin,2017,67（1）:7⁃30.DOI:10.3322/caac.21387.

［2］Wang C,Yue Y,Shao B,et al.Dickkopf⁃related protein 2 is epigenetically inactivated and suppressescolorectalcancer growth and tumor metastasis by antagonizing Wnt/β ⁃catenin signaling［J］.Cell Physiol Biochem,2017,41（5）:1709 ⁃1724.DOI:10.1159/000471861.

［3］Yu J,Tao Q,Cheng YY,et al.Promoter methylation of the Wnt/beta⁃catenin signaling antagonist Dkk⁃3 is associated with poor survival in gastric cancer［J］.Cancer,2009,115（1）:49⁃60.DOI:10.1002/cncr.23989.

［4］Ueno K,Hirata H,Majid S,et al.Wnt antagonist DICKKOPF⁃3（Dkk⁃3）induces apoptosis in human renal cell carcinoma［J］.Mol Carcinog,2011,50（6）:449⁃457.DOI:10.1002/mc.20729.

［5］Xiang T,Li L,Yin X,et al.Epigenetic silencing of the WNT antagonist Dickkopf 3 disrupts normal Wnt/β⁃catenin signalling and apoptosis regulation in breast cancer cells［J］.J Cell Mol Med,2013,17（10）:1236⁃1246.DOI:10.1111/jcmm.12099.

［6］Ueno K,Hirata H,Majid S,et al.Wnt antagonist DICKKOPF⁃3（Dkk ⁃3）induces apoptosis in human renal cell carcinoma［J］.Mol Carcinog,2011,50（6）:449⁃457.DOI:10.1002/mc.20729.

［7］You A,Fokas E,Wang LF,et al.Expression of the Wnt antagonist DKK3 is frequently suppressed in sporadic epithelial ovarian cancer［J］.J Cancer Res Clin Oncol,2011,137（4）:621 ⁃627.DOI:10.1007/s00432⁃010⁃0916⁃6.

［8］Sun Y,Jin SD,Zhu Q,et al.Long non⁃coding RNA LUCAT1 is associated with poor prognosis in human non⁃small lung cancer and regulates cell proliferation via epigenetically repressing p21 and p57 expression［J］.Oncotarget,2017,8（17）:28297⁃28311.DOI:10.18632/oncotarget.16044.

［9］Li C,Lyu J,Meng QH.MiR ⁃93 promotes tumorigenesis and metastasis of non⁃small cell lung cancer cells by activating the PI3K/Akt pathway via inhibition of LKB1/PTEN/CDKN1A［J］.J Cancer,2017,8（5）:870⁃879.DOI:10.7150/jca.17958.

［10］Chikara S,Lindsey K,Dhillon H,et al.Enterolactone induces G1⁃phase cell cycle arrest in nonsmall cell lung cancer cells by downregulating cyclins and cyclin ⁃dependent kinases［J］.Nutr Cancer,2017,69（4）:652 ⁃662.DOI:10.1080/01635581.2017.1296169.

［11］Wu BQ,Jiang Y,Zhu F,et al.Long noncoding RNA PVT1 promotes EMT and cell proliferation and migration through downregulating p21 in pancreatic cancer cells［J］.Technol Cancer Res Treat,2017:1533034617700559.DOI:10.1177/1533034617700559.

［12］Katkoori VR,Suarez⁃Cuervo C,Shanmugam C,et al.Bax expres⁃sion is a candidate prognostic and predictive marker of colorectal cancer［J］.J Gastrointest Oncol,2010,1（2）:76 ⁃89.DOI:10.3978/j.issn.2078⁃6891.2010.019.

［13］Yao C,Cao X,Fu Z,et al.Boschniakia rossica polysaccharide triggers laryngeal carcinoma cell apoptosis by regulating expres⁃sion of Bcl⁃2,Caspase⁃3,and P53［J］.Med Sci Monit,2017,23:2059⁃2064.

Effects of tumor suppressor gene Dickkopf⁃3 on proliferation and apoptosis of cutaneous malignant melanoma cells

Li Jing,Yu Yin,Liu Linhong,Li Zhi,Diao Qingchun,Wang Kaizhen,Xiao Liang,Liu Sutao
Department of Dermatology,Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital,Chongqing 400011,China（Li J,Yu Y,Liu LH,Li Z,Diao QC,Liu ST）;Department of Nephrology,Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital,Chongqing 400011,China（Wang KZ）;Department of Orthopedics,Shiyan People′s Hospital,Shiyan 442000,HuBei,China（Xiao L）

Liu Sutao,Email:284112611@qq.com

ObjectiveTo investigate the expression of Dickkopf⁃3（DKK3）in human malignant melanoma cell lines and tissues,and to evaluate effects of DKK3 on the proliferation and apoptosis of malignant melanoma cell line A375.MethodsReverse transcription PCR（RT⁃PCR）and real⁃time fluores⁃cence⁃based quantitative PCR（qRT⁃PCR）were performed to measure the mRNA expression of DKK3 in human malignant melanoma cell lines HM,A375,WM451,WM35,SK⁃MEL⁃1,Hs⁃695T and MDA⁃MB⁃435s,as well as in 38 primary melanoma tissues,4 metastatic melanoma tissues and 20 pigmented nevus tissues.Cultured malignant melanoma A375 cells were divided into 2 groups to be transfected with pcDNA3.1（+）⁃Flag⁃DKK3（experiment group）and pcDNA3.1（+）⁃Flag⁃Vector（control group）respectively.The overexpression of DKK3 was verified by RT⁃PCR.Cell counting kit⁃8（CCK8）assay and plate colony formation assay were performed to evaluate the proliferative activity of A375 cells,flow cytometry was conducted to detect apoptosis of A375 cells,and Western blot analysis was performed to determine the expression of cell cycle⁃and cell apoptosis⁃related proteins.ResultsThe mRNA expression of DKK3 was downregulated in WM35 cells,absent in HM cells,A375 cells,WM451 cells,SK⁃MEL⁃1 cells and Hs⁃695T cells,but upregulated in MDA⁃MB⁃435s cells.Compared with pigmented nevus tissues,the mRNA expression of DKK3 was significantly decreased in malignant melanoma tissues（P＜ 0.001）.Compared with the control group（100%）,cell colony formation was markedly suppressed in the experiment group（23.22% ±3.55%）,and the proliferative activity of A375 cells was also significantly inhibited in the experiment group 24,48,72 hours after the transfection（allP＜ 0.05）.Flow cytometry showed that compared with the control group,A375 cells were significantly arrested in G1 phase（48.68% ±3.92%vs.25.38% ±2.92%,P＜0.001）,and the apoptosis rate of A375 cells was significantly increased in the experiment group（P＜ 0.001）.Compared with the control group,the experiment group showed significantly higher expression of p21,Bax,cleaved⁃parp and cleaved⁃casp3,but significantly lower expression of cyclin D1 and Bcl2（allP＜ 0.001）.ConclusionDKK3 expression is downregulated in human malignant melanoma tissues,so it may serve as a potential tumor suppressor gene involved in the development of cutaneous malignant melanoma.

Melanoma;Cell proliferation;Apoptosis;DKK3;Tumor suppressor genes

刘素桃，Email：284112611@qq.com

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2017.12.010

2017⁃05⁃03）

吴晓初）