酸性成纤维细胞生长因子复合胶原蛋白对兔前交叉韧带重建后腱-骨愈合的影响

逯代锋, 杨传东, 董 锋, 周 勇, 严 实

·实验与临床·

酸性成纤维细胞生长因子复合胶原蛋白对兔前交叉韧带重建后腱-骨愈合的影响

逯代锋, 杨传东, 董 锋, 周 勇, 严 实

目的观察酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)复合胶原蛋白对兔前交叉韧带(ACL)重建后腱-骨界面愈合的影响。方法将30只新西兰白兔随机分为实验组与对照组,每组15只,均取趾长伸肌腱作为移植物。实验组将aFGF/胶原蛋白复合物植入到重建的ACL腱-骨界面,对照组单纯行ACL重建。于术后第4、8、12周分别处死动物取材,将股骨与胫骨端分别固定于生物力学试验机上,测试移植肌腱的腱-骨界面抗拉伸强度,取其绝对值作比较;同时,将股骨隧道和胫骨隧道纵向剖开,取下标本组织学观察移植物界面愈合情况。结果术后第4、8、12周抗拉力强度实验组强于对照组,差异有统计学意义(P<0.001)。两组动物均在第4周时移植物与骨隧道之间均形成了纤维结缔组织。术后第12周,实验组肌腱移植物在骨隧道内形成了纤维软骨移行带,类似于正常的纤维软骨连接,而对照组则形成了走向与骨隧道轴向垂直的Sharpey样纤维。结论aFGF复合胶原蛋白能促进兔ACL重建腱-骨界面的早期直接愈合。

酸性成纤维细胞生长因子;前交叉韧带重建;腱-骨愈合

关节镜下前交叉韧带(ACL)重建术是治疗ACL损伤、纠正膝关节不稳和延缓膝关节退行性变的重要方法。以腘绳肌腱为移植物末端生物学固定属于腱-骨愈合,愈合时间长,愈合强度不确定,限制了患者早期的康复训练,进而影响韧带重建的最终治疗效果,能否解决腱-骨愈合不良问题成为评判ACL重建是否成功的重要指标[1]。近年来应用生物生长因子促进骨隧道内的腱-骨愈合越来越受到学者们的重视[2]。研究表明[3],酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)可促进分化中的软骨细胞发生迁移和集落形成,促进软骨细胞的增殖和成熟,可应用于ACL重建,促进腱-骨愈合,但由于“滑液灌注效应”的影响,腱-骨界面单纯应用aFGF易流失。胶原蛋白为研究成熟的具有缓释功能的载体材料,本研究采用aFGF与胶原蛋白复合体植入重建ACL的兔模型的腱-骨界面,评估其对腱-骨早期愈合的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组健康清洁级新西兰大白兔30只, 雌雄各15只,月龄为6～8个月,体重2.0～4.0(3.15±0.61)kg,由哈尔滨医科大学附属第四医院动物实验中心提供。采用随机数字表法将30只兔分为实验组与对照组,每组15只。

1.2主要材料与仪器荧光显微镜(BX43奥林巴斯,日本),生物力学测试机(3342 INSTRON CORPORATION,单臂式电子拉伸机,美国),aFGF由暨南大学提供。

1.3实验方法

1.3.1aFGF/ 胶原蛋白复合物的制备 ① 胶原蛋白的制备:将新鲜牛跟腱去除脂肪、筋膜后, 清洗干净, 置-20 ℃ 冰箱冷冻硬化;取出后沿着腱纤维方向切成均匀薄片,取100 g 用去离子水洗净, 用75%乙醇消毒30 min, 双蒸水反复清洗后放入1 L 0.5 mol/L 冰醋酸中, 置4 ℃冰箱 24 h 以上, 间歇搅拌;将膨胀的胶原倒入高速组织捣碎机中捣碎成浆糊样;放入4 L 0.5 mol/L冰醋酸中, 同时加入1 g 胃蛋白酶, 置4 ℃ 冰箱24 h 以上,充分溶解; 取上清液置预冷为4 ℃离心机内, 4 000 r/min 离心30 min;取上清液倒入容量瓶中定容, 加入等量的20% NaCl 溶液进行盐析48 h 以上;将析出的絮状沉淀再次溶于2 L 0.5 mol/L冰醋酸中, 用双层纱布过滤,去除胶原溶液中残存的少许絮状物;将所得胶原蛋白溶液灌入透析袋中用双蒸水透析5 d 以上, 每日换水2 次, 即得到胶原蛋白溶液。② aFGF/胶原蛋白复合物的制备:在15 ml 胶原蛋白溶液中加入4 μg aFGF, 冷冻干燥后可制成aFGF/胶原蛋白复合物,aFGF 的浓度为267 μg/L。实验前所有的测试样品均用60Co 作灭菌处理。

1.3.2动物模型制备 在兔左后腿内侧口取出趾长伸肌腱作为移植物,两端用缝合线缝合备用。再从右后腿髌骨内侧行纵向切口,分别从上下止点处将ACL切除,在胫骨结节内上方的骨面原ACL止点残端定位,用1.2 mm钻头钻骨道作为下止点;同法于股骨外髁钻骨道作为上止点。将预先缝在移植物两端的缝合线牵出关节腔,继而牵拉移植物两端进入骨道内。上下止点固定:先用克氏针在胫骨结节稍偏下的皮质骨上钻孔,将其中1根缝线穿孔而过,绕回后与下端另1根缝线打结固定;然后在股骨干部韧带终点外侧以克氏针从外向内斜行钻2个单皮质骨道,外孔间隔0.3 cm,将缝线两端穿过骨道后屈膝位90°位拉紧韧带打结固定。用1号不可吸收线固定。实验组将aFGF/胶原蛋白复合物植入到重建的ACL骨隧道内;对照组单纯行ACL重建。

1.3.3生物力学检测 于术后第4、8、12周每组分别取5只兔,经空气栓塞法处死取材。将膝关节ACL外周软组织去除,股骨和胫骨各保留5 cm长,股骨与胫骨端分别固定于生物力学试验机上,使拉力经过韧带的轴线。测试前去除胫骨端移植肌腱骨道外的软组织及缝线结构,使胫骨端腱-骨界面成为拉力测试对象。行最大拉脱负荷实验,测试移植肌腱的腱-骨界面抗拉伸强度,按5 mm/min速度加载负荷,记录拉脱或断裂负荷。因各测试对象的移植肌腱长度、骨道直径和长度接近,各组样本的最大载荷未用隧道长度来标准化,直接取其绝对值作比较。

1.3.4组织学观察 在术后第4、8、12周每组分别将取得的膝关节标本取股骨髁上1 cm部位及胫骨结节下方0.5 cm完整切断。15%戊二醛溶液固定,10% EDTA磷酸缓冲液脱钙。脱钙后以蒸馏水冲洗,清除关节周围软组织,将股骨隧道和胫骨隧道纵向剖开,取下标本并修整成1 cm×0.5 cm×0.5 cm大小。依次梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋,切成5μm厚的薄片,常规HE染色,观察骨隧道内移植物界面愈合情况。

2 结果

2.1生物力学检测见表1。两组术后第4、8、12周的抗拉力强度比较差异均有统计学意义(P<0.001)。

2.2组织学观察术后第4周,实验组腱-骨界面胶原纤维排列紧密、有序,新生骨细胞较多且比较成熟;对照组腱-骨界面组织疏松、无序,成骨不明显;

表1 两组腱-骨界面术后不同时间点抗拉力强度比较

两组均未见Sharpey纤维；见图1A、B、C。术后第8周,实验组可见排列密集的垂直腱-骨界面的Sharpey样纤维,纤维及新生骨长入肌腱;对照组偶见Sharpey样纤维,新生骨细胞趋向肌腱生长,腱-骨结合疏松;见图1D、E、F。术后第12周,实验组腱-骨界面几乎全部由新生骨填充,新生纤维软骨、钙化软骨及骨细胞成熟,Sharpey样纤维较术后第8周时减少,形成“潮线”样结构;对照组腱-骨界面逐渐成熟,形成少量的纤维软骨,但是纤维软骨分化较差,腱-骨过渡组织狭窄,无“潮线”结构;见图1G、H、I。

3 讨论

我国每年有60万～70万例行ACL重建手术的患者,但术后有2.1%～11%的患者出现膝关节的松弛而接受二次手术治疗[4]；美国每年有10万～15万例需接受ACL重建手术以恢复正常结构和功能[5],但术后仍有0.7%～10%的患者因关节不稳接受二次手术[6]。腱-骨愈合的好坏直接影响ACL重建的效果。研究表明[7-8]腱-骨愈合分为间接愈合和直接愈合,间接愈合的特征为一些穿插性的胶原纤维连接肌腱移植物和骨隧道,这种纤维的走向通常与骨隧道轴向垂直,称为Sharpey样纤维;直接愈合特征是通过纤维软骨移行带连接移植物和骨隧道,类似于正常的纤维软骨连接,且形成嗜碱性染色的“潮线”结构,见于正常ACL的腱-骨止点或腱-骨愈合晚期的骨隧道出口处[9]。大多数学者认为间接愈合在力学上不如直接愈合,只有移植肌腱与骨隧道壁形成牢固的愈合才能达到有效的力学强度[10]。因此促进ACL重建后腱-骨早期、可靠的愈合成为研究热点。王永健 等[11]用自体腘绳肌腱重建兔ACL,6个月观察到直接止点的4层结构,12个月与正常ACL的止点相似;有研究表明[12]腱-骨界面形成正常止点需要24周以上。aFGF对中胚层来源的细胞包括成骨细胞、成软骨细胞有明显的促有丝分裂作用, 并且能刺激新生毛细血管的形成[13],但是它对于腱-骨愈合的影响未见相关报道。胶原蛋白具有低抗原性, 良好的生物相容性和生物可降解性,胶原蛋白在细胞的增生分化与运动、血液凝固、伤口愈合中起重要作用,胶原作为生物材料可用于创伤敷料、止血材料、手术缝线、药物缓释载体等[14-16]。本研究将胶原作为载体能使aFGF在腱-骨界面持续发挥作用。

图1两组术后腱-骨界面的愈合情况A.术后4周，实验组见胶原纤维排列紧密,HE×100;B.术后4周，实验组见胶原纤维排列有序,HE×400;C.术后4周，对照组见胶原纤维排列疏松,HE×100;D.术后8周，实验组见Sharpey纤维致密,HE×100;E.术后8周，实验组见Sharpey纤维排列、其间可见软骨细胞,HE×400;F.术后8周，对照组见Sharpey纤维疏松,HE×100;G.术后12周，实验组见直接止点,HE×100;H.术后12周，实验组见新生纤维软骨、钙化纤维软骨及骨组织成熟,HE×400;I.术后12周，对照组见少量新生骨细胞,腱骨界面疏松,HE×100

ACL重建术后早期功能锻炼时移植肌腱所承受的应力负荷与腱-骨间接愈合有关[17],所以Sharpey纤维数量决定了移植肌腱的抗拉程度。本实验结果显示,术后4周两组未见Sharpey纤维,实验组的胶原纤维比对照组致密、有序;术后8周两组可见数量不等的Sharpey纤维,但实验组明显多于对照组;术后12周时,实验组Sharpey样纤维明显减少,被连续性的纤维软骨、钙化纤维软骨连接取代,近似于直接止点结构,对照组Sharpey样纤维多,形成少量的纤维软骨;生物力学检测两组比较差异有统计学意义,表明aFGF复合胶原蛋白可明显提高ACL重建术后早期的移植肌腱的生物力学性能。

有研究认为[18],移植肌腱直径小于隧道直径,彼此间在关节的每次运动时,会产生腱-骨间的微小移动和关节滑液的隧道冲刷。aFGF为可溶性蛋白,由于“滑液灌注效应”的影响,在骨道内单纯应用容易流失,胶原蛋白有骨传导活性,二者结合在一起能使腱-骨之间形成严密的栓塞,关闭关节腔和隧道的孔隙交通,能减少“滑液灌注效应”,并能减少移植肌腱在骨道内横向及纵向活动所形成的“雨刷效应”和“蹦极效应”[19],缓慢释放的aFGF有利于长效诱导腱-骨界面的直接愈合。Gulotta et al[20]将黏合剂填入腱-骨界面内显示腱-骨愈合更牢固,说明减少“滑液灌注效应”可有效促进腱-骨愈合。本实验发现,术后各时间段aFGF复合胶原蛋白组移植肌腱的抗拉力、腱-骨界面的成熟度、Sharpey纤维数量均好于对照组,并且实验组在术后12周形成了纤维软骨移行带,类似于正常的纤维软骨连接,说明aFGF复合胶原蛋白能促进ACL重建腱-骨界面的早期直接愈合。

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Effectofacidicfibroblastgrowthfactorcomplexcollagenontendon-bonehealingafterACLreconstructionofrabbits

LUDai-feng,YANGChuan-dong,DONGFeng,ZHOUYong,YANShi

(DeptofOrthopaedics,theFourthAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin,Heilongjiang150001,China)

ObjectiveTo observe the effects of acidic fibroblast growth factor(aFGF) complex collagen on tendon-bone interface healing in anterior cruciate ligament(ACL) reconstruction of rabbits.MethodsThe 30 New Zealand white rabbits were randomly divided into experimental group and control group,each 15 only,all were taken toe long extensor tendon as graft. Experimental group aFGF/collagen composite were implanted to the reconsruction of the ACL tendon-bone interface,control group underwent pure ACL reconstruction.In 4,8,12 weeks after surgery，animals were put to death,femur and tibia end were respectively fixed on the biomechanical test machine,tested hamstring tendon transplantation-bone interface tensile strength,took the absolute value comparison;At the same time,the femoral and tibial tunnel were opened longitudinally tunnel, removed the specimen histological observation graft interface healing.ResultsAt 4,8,12 weeks postoperation, pushing of the experimental group was stronger than the control group, the difference was statistically significant(P<0.001).At 4 weeks posoperation, two groups animals had formed fibrous connective tissue between implant and bone tunnel. At 12 weeks postoperation, the experimental group tendon grafts had formed fibrocartilage transitinonal zone in bone tunnel, which was similar to normal fibrocartilage connection, while control group had formed a trend and bone tunnel axis vertical Sharpey sample fibers.ConclusionsThe aFGF-collagen is beneficial to the early direct healing of tendon-bone interface after anterior cruciate ligament reconstruction.

acidic fibroblast growth factor;anterior cruciate ligament reconstruction;tendon-bone healing

10.3969/j.issn.1008-0287.2017.06.041

黑龙江省卫生计生委科研课题(编号:2014-375)

哈尔滨医科大学附属第四医院骨科,黑龙江 哈尔滨 150001

逯代锋,男,副主任医师,主要从事运动医学研究,E-mail:ludaifengletter@163.com

R 686.5;R 687.2

A

1008-0287(2017)06-0752-05

(接收日期:2017-09-20)