中性粒细胞外诱捕网在急性冠脉综合征中的研究进展

钱叶舟，杨爽

早在2004年，Brinkmann等就发现当遭受白介素-8（IL-8）、佛波酯（PMA）或脂多糖刺激时，中性粒细胞可释放出一种名为中性粒细胞外诱捕网（NETs）的细胞外杀菌结构。它是以DNA为骨架，上面附着中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）和髓过氧化物酶（MPO）等抗菌蛋白和瓜氨酸化组蛋白的网状结构，且NETs中不含有肌动蛋白和微管蛋白等细胞质蛋白成分[1]。起初NETs主要功能是捕获并杀死细菌，病毒和真菌等病原微生物，随后研究发现，其在慢性阻塞性肺疾病、系统性自身免疫疾病、糖尿病、动脉粥样硬化和急性冠脉综合征中也扮演了重要角色[2-6]。急性冠脉综合征（ACS）主要包括ST段抬高型心肌梗死（STEMI）、非ST段抬高型心肌梗死和不稳定型心绞痛，尽管诊疗技术不断提高，但其发病率和死亡率仍居高不下，造成了严重的经济和社会负担[7]。从升高的中性粒细胞计数预示心血管不良事件[8]，到Quillard等在破裂斑块和侵蚀斑块，这两种导致ACS的主要罪犯病变中发现了大量NETs存在，提示其可能在ACS的发生发展中扮演了重要角色[9]。本文就NETs的研究现状和在ACS中的研究进展进行阐述。

1 NETs形成的诱因和机制

根据形成NETs后中性粒细胞的活性和功能是否保存，NETs的形成机制主要由两种：自杀性NETosis和有活力的NETosis。PMA作为体外试验中最常用到的自杀性NETosis诱导物，在其刺激人中性粒细胞20 min后，会有大量活性氧（ROS）在还原型辅酶Ⅱ（NADPH）的作用下产生[10]，ROS可使中性粒细胞嗜天青颗粒中的NE、MPO等释放出来，NE转位到细胞核中后，降解特定的组蛋白并促进核染色质解聚，而MPO可通过一种不依赖其酶活性的方式进一步促进核染色质解聚[11]。肽基精氨酸脱亚胺酶4（PAD4）可使组蛋白瓜氨酸化并和MPO等颗粒蛋白混合后随着DNA骨架一起排出到中性粒细胞外[12]。值得注意的是，虽然PMA很容易诱导出NETosis，但其作为一种人为的刺激对于我们研究NETosis有很大的不足之处。Kenny等用不同的刺激物（PMA，钙离子载体A23187，尼日利亚菌素，白色念珠菌，B型链球菌）来刺激中性粒细胞时发现，对于不同刺激，ROS、MPO、NE和组蛋白瓜氨酸化都不是NETosis所必须的[10]。

不同于自杀性NETosis数小时的反应过程和细胞膜的破裂以及细胞功能的丧失，Pilsczek等在2010年发现，在金黄色葡萄球菌的刺激下，中性粒细胞以一种快速的（5～60 min）、不依赖NADPH的途径释放出NETs且保持细胞膜完整，称之为有活力的NETosis[13]。Pieterse等发现当血小板存在时，革兰阴性菌的脂多糖会通过这种途径，诱导中性粒细胞释放NETs且其不依赖ROS的产生和自噬，但需要TLR4和CD62P的参与[14]。在一例使用肺炎球菌溶血素诱导的有活力的NETosis中，TLR4却不是反应所必需的[15]。相比于自杀性NETosis，有活力的NETosis可能更贴近生理条件，因为有关于自杀性NETosis的研究多基于PMA这一非生理性刺激。

2 NETs与斑块破裂

导致ACS的三种潜在机制：主要斑块破裂、斑块侵蚀和钙化结节，其中斑块破裂是最常见的病理生理机制[16]。它的主要特点是高度的炎症反应，多含有丰富的胆固醇脂质池和薄的纤维帽[17]。Stakos等研究显示，斑块破裂处的血栓和已激活的血小板相互作用可促进附近的NETs生成，表达于NETs中DNA骨架上的组织因子（TF）促进破裂斑块处血栓的形成并通过PAR信号通路激活血小板[18]。活化的血小板可能是通过释放高迁移率族蛋白1（HMGB1）使中性粒细胞发生自噬和NETosis，因为缺乏HMGB1的血小板不能诱导NETosis[19]。此外斑块破裂后释放出的胆固醇结晶，也可促进NETosis，NETs的生成会诱导斑块附近的巨噬细胞分泌IL-1β，使T细胞分泌的IL-17、趋化因子CXCL1和CXCL2增加，促进中性粒细胞在斑块破裂处的募集，这一正反馈环路加剧斑块处的无菌性炎症反应，促进病变进展[20]。斑块内出血是导致斑块破裂的一个重要原因，一项关于颈动脉粥样硬化斑块内出血的研究显示在出血斑块内有大量NETs生成，其强烈的氧化应激和蛋白酶活性可能会导致斑块稳定性进一步削弱从而发生斑块破裂[21]。

3 NETs与斑块侵蚀

约22%～44%的ACS患者被证明是因为斑块侵蚀导致的，不同于斑块破裂，其病理特征为斑块中丰富的平滑肌细胞和蛋白聚糖以及表面内皮细胞的剥脱。光学相干断层成像技术显示侵蚀斑块中纤维帽保持完整，残余管腔较大且血栓中富含血小板[22]。血液中的MPO主要来源于被激活的PMN，其也是NETs中常见的颗粒蛋白，Ferrante等发现相比于斑块破裂，发生斑块侵蚀的患者血浆中的MPO水平明显增高。将冠心病猝死患者的病变血管进行免疫组化染色后发现，斑块侵蚀血栓中MPO阳性的细胞的密度明显大于位于斑块破裂中的血栓[23]。血管内皮细胞凋亡剥脱作为斑块侵蚀的主要特点，其中内皮细胞上TLR2受体可能发挥着重要作用，在遭受其配体如脂磷壁酸等的刺激时，内皮细胞会发生剥脱和凋亡并分泌IL-8来募集中性粒细胞，且这一现象在中性粒细胞存在的情况下会得到加强。此外，还发现在侵蚀斑块中大片凋亡的内皮细胞附近有丰富的中性粒细胞和NETs存在。因此他们认为侵蚀斑块的形成主要有两次打击：一次是TLR2受体所导致的内皮损伤、凋亡、或剥脱；第二次是中性粒细胞趋化到病变部位放大、维持并传播局部的反应。在他们的研究中NETs和TLR2受体越丰富的地方，凋亡内皮细胞越多，提示NETs在斑块侵蚀中可能起到重要作用[9]。

4 NETs与冠状动脉血栓

Mangold等在对111个STEMI患者的冠状动脉血栓进行研究后发现，血栓中的中性粒细胞被高度激活（TLR2和TLR4表达增加）且和血小板聚集在一起。此外这些血栓中含有大量的NETs，罪犯病变处NE和MPO的水平也显著升高，用脱氧核糖核酸酶（DNase）处理可明显加速血栓溶解[6]。Boer等在对急性心肌梗死患者冠状动脉中取出的新鲜、溶解和机化期血栓进行免疫组化染色后发现，中性粒细胞在新鲜、溶解期血栓中含量丰富且NETs在这两种血栓尤其是溶解期的血栓中频繁出现（80%），机化期血栓没有NETs的痕迹。研究发现这两种血栓中的的NETs附着有IL-17A/F，可通过血小板上的受体（IL17RA）促进血小板的聚集来起到稳定血栓的作用[24]。除此之外，NETs本身可直接作为血小板和红细胞附着的支架并激活血小板，诱导富含红细胞的血栓形成，并可通过结合血管性假性血友病因子（VWF）、纤连蛋白和纤维蛋白原来维持血栓稳定。因为只有在DNase和组织型纤溶酶原激活物（tPA）同时存在的情况下，活化的中性粒细胞难以促进血栓形成，单一的tPA虽然可降解纤维蛋白但其并不能阻止血栓形成，提示NETs本身可以为血栓形成的支架在血栓形成中发挥重要作用[25]。

5 结语

在正常条件下，NETs可很好的发挥其捕捉并杀灭病原微生物的固有免疫作用，但在病理条件下，其作为一柄双刃剑参与疾病的发生和发展并造成不良预后，在ACS中尤为明显，ACS患者升高的中性粒细胞计数和紊乱的生理状态为NETs的产生和发展提供了良好基础，各种研究也证实了其在ACS的发生和发展中起到关键作用。NETs在ACS患者中的作用需进一步研究，这对预防和治疗ACS都有重要意义。