“耳郭软骨组织工程的研究进展”点评

曹谊林

先天性小耳畸形主要表现为重度耳郭发育不全，伴外耳道闭锁或狭窄，是较为常见的新生儿出生缺陷。该病在我国发病率较高。目前临床治疗手段仍以自体肋软骨移植耳郭再造或人工支架植入为主。前者供区损伤大，且难以精确控制形态；后者为人工材料，形态可控但无生物学功能，易发生异物反应及假体外露等并发症。因此，如何更有效地修复耳郭结构，重建其功能仍是整形外科治疗的难题。组织工程技术利用患者废弃的自体残耳软骨细胞复合支架材料再生耳郭形态软骨，可实现耳郭结构重建和功能修复。这一优势使其成为耳再造的重要研究方向。经过几十年的发展，各类软骨的组织工程修复技术已在动物体内取得较大成功，且组织工程软骨的临床应用尝试也获得了一定进展，但要实现临床应用转化，仍有一些关键科学问题需阐明。

1 种子细胞

文中已详细描述了软骨组织工程常用的种子细胞来源及其特点。软骨细胞增殖能力强，且软骨再生稳定性好，因此仍是目前最为重要的种子细胞来源。但由于其在体外大量扩增过程中，容易发生去分化、功能丧失，这一特性极大限制了其进一步的临床应用转化。为解决软骨细胞去分化问题，研究者通过改进或优化体外培养体系，如培养体系中增加有效的生长因子、建立适宜的体外3D培养体系等手段，以延缓软骨细胞的去分化速度或使去分化的软骨细胞发生重分化，最终达到稳定或维持软骨细胞表型的目的。这些研究成果不仅有望获得功能完全的软骨细胞，同时还能满足构建大块软骨组织对细胞数量的要求，最终有望解决软骨细胞临床应用中的质量及数量问题。

除软骨细胞外，文中还提到了骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)和脂肪间充质干细胞(adipose-derived stromal cells, ASCs)等成体干细胞。上述细胞中，尤其是BMSCs具有取材方便、来源较充足、取材创伤相对小、成软骨能力强等优势，这使其成为软骨组织工程较为理想的种子细胞之一。研究者通过软骨分化诱导体系、基因重组技术转染诱导体系、共培养技术等手段，能成功地将BMSCs诱导成具有软骨特性的软骨样组织。对于临床应用转化而言，上述手段中，外源性蛋白和基因转染技术显然不适用。相对而言，软骨分化诱导及共培养技术可能更有临床应用前景。尽管如此，我们课题组前期研究发现，BMSCs体外诱导获得的成熟软骨组织在皮下微环境中极易发生血管化、骨化，最终软骨再生失败。而将软骨细胞与BMSCs共培养后植入动物皮下，则可获得成熟稳定的软骨再生效果。我们进一步研究发现这是由于软骨细胞能分泌一些抗血管化细胞因子(如软骨调节素Ⅰ)，从而稳定了BMSCs的体内软骨再生。由此可见，解决血管化、骨化问题是BMSCs皮下软骨再生稳定性的关键。

2 支架材料

文中已详细描述了软骨组织工程常用的支架材料来源。主要有天然生物材料、人工合成材料及复合材料3种类型。 常用的天然生物材料除文中提到的藻酸盐、壳聚糖、胶原，还有脱细胞基质材料、透明质酸等。这些材料最大的优点是无明显的细胞毒性，生物相容性好，植入体内后无明显炎症反应或仅引起轻微的炎症反应。因此软骨细胞与之复合植入体内后软骨再生较为稳定。然而遗憾的是，这些材料也存在明显的局限性，如力学性能较差、难以精确塑形、体内降解较快等。因此，这些天然材料在可注射性组织工程软骨中更具有优势。近年来，研究者也在努力改进、优化材料的特性，使其适用范围更广。如通过交联技术、光敏技术、温敏技术、冻干技术等提高胶原材料的可塑性及力学强度；通过改进脱细胞技术提高脱细胞基质支架材料的强度及细胞黏附率等。材料的优化有望为软骨组织工程技术提供更理想的支架材料。

人工合成材料常用的有：多孔聚乙烯(Medpor)、聚己内酯(poly-caprolactone, PCL)、聚羟基乙酸(poly-glycolic acid, PGA)和聚乳酸(poly-lactic acid，PLA)等。这些合成材料不仅来源广、易于获取，更重要的是具有可塑性强，可精确控制形态；力学性能好，植入体内后形态能维持良好等优势。这些优势使其非常适合作为耳郭形态软骨构建的支架材料。但同样的，这些材料也有不足之处，最大的缺点是组织相容性较差，材料本身及其降解产物植入体内后，会激发机体的异物炎症反应，从而干扰软骨体内再生。此外，材料缺乏柔韧可屈曲的特性、外露、感染等问题也是限制人工合成材料进一步应用的关键因素。

为克服上述天然材料和人工合成材料各自的不足，取其长补其短，研究者们尝试了不同方式(物理或化学方法)将2种或者2种以上的天然材料和人工合成材料进行复合，从而获得组织相容性较好、形态可控、力学性能合适的复合材料。如文中提及的丝蛋白-藻酸盐3D多孔耳郭支架、胶原/PLA, 壳聚糖/PLA和 胶原/壳聚糖/PLA等。这些研究成果为软骨再生技术提供了重要参考依据，但这些支架材料在人体内的安全性及有效性仍不明确。因此，要实现临床应用转化还有很长的路要走。

3 展望

自1997 年笔者在裸鼠背上成功构建出人耳郭形态软骨以来，软骨组织工程技术获得较大的发展。最重要的是，组织工程耳郭形态软骨的临床试用研究已获得了成功。该临床试验主要以自体残耳软骨细胞复合PGA/PLA-PCL支架，体外构建耳郭形态软骨用以重建小耳症患者耳郭。经过2.5年的随访，初步证实了该方法的有效性。尽管如此，要实现组织工程耳郭的大规模临床应用，一些关键科学问题仍需阐明，一些关键参数仍需进一步优化及改进，如更长期的体内转归如何？尤其是PCL内核完全降解后耳郭的形态如何？强度如何？后期软骨有无进一步吸收？此外，如何优化软骨细胞体外培养及扩增体系、如何优化改进目前支架材料的制备工艺、如何优化支架性能、如何提高体外构建软骨的质量及功能等，这些问题均是后续研究的重要方向。