梅毒螺旋体黏附相关蛋白研究进展

周 盼 李凤娟 张瑞华 许 翠 李黎明 蒋明军

梅毒是由苍白密螺旋体(又称梅毒螺旋体，TP)感染引起的一种慢性、系统性性传播疾病。其临床表现复杂多样，可累及多个器官和系统，严重危害患者身心健康。妊娠期梅毒感染还可导致流产、早产、死胎、畸胎、先天性梅毒及远期后遗症等[1]；梅毒感染还能增加罹患或传播艾滋病的风险[2]。据估计[3]，2012年全球15～49岁人群中约有1800万例梅毒患者，其中新发病例约600万例。国内梅毒感染率和发病率也居高不下[4]。所以，如何有效控制和预防梅毒感染已成为全球普遍关注的公共卫生问题。

梅毒螺旋体具有强大的组织侵袭能力，不仅可引发广泛的二期梅毒疹(其中肝、肾、眼等内脏也常受累)；还能穿透胎盘屏障、血脑屏障导致先天梅毒及神经梅毒[5]；在实验动物体内，TP由局部皮肤感染后，可在数小时内经血液或淋巴发生播散[6]；体外实验中，TP还可穿透完整的生物膜及内皮细胞间紧密连接[7,8]。TP强大的侵袭力与其复杂的临床表现密切相关。

由于TP为胞外致病菌，故其膜蛋白在致病中的作用一直是研究热点。TP细胞膜由内外两层组成，与G-菌不同的是，TP外膜缺乏脂多糖，且膜蛋白含量极少，尚不足大肠杆菌的百分之一，因而称之为TP稀有外膜蛋白(TROMP)[9]。因表面缺乏靶抗原，宿主免疫系统不能产生针对TP有效的保护性抗体，这也给疫苗的开发带来了巨大困难。无法在体外连续培养、基因操作困难、细胞膜易碎难以提取等因素，则严重限制了TP膜蛋白的鉴定和研究。

近年来随着TP基因组序列的阐明及分子生物学技术的发展，人们对TP膜蛋白的认识逐渐深入。其中多种与TP侵袭力密切相关的黏附蛋白也逐渐被发现。它们不仅可介导TP与宿主基底膜(basement membrane,BM)及细胞外基质(extracellular matrix,ECM)等的相互作用，还可利用自身蛋白酶活性(如Tp0751、Tp0750)使这些组织降解，继而穿透基底膜及内皮细胞间紧密连接，发生组织侵袭或随血液播散。Tp0751还有促炎作用，Tp0435(Tp17)有较强的免疫原性和免疫反应性，可能具有潜在的诊断价值；而Tp0136具有显著的菌株间异质性，可能与TP免疫逃避机制有关。本文将对目前已知的几种具有黏附功能的膜蛋白进行概述。

1 Tp0136

Tp0136基因全长1488 bp,编码约495个氨基酸，相对分子量约50 KDa。基因在不同菌株间存在高度异质性[10-13]，是Tp0136与其它黏附蛋白最显著的不同。Brinkman等[14]对Street14、Samoa D、Samoa F、Cuniculi A 4种不同菌株的Tp0136基因进行PCR扩增和DNA测序，并与Nichols标准株进行对比，发现Tp0136基因在不同菌株间存在多处核苷酸错配、插入和缺失，这些差异最终导致不同菌株间Tp0136氨基酸序列的差异。Ke等[15]对Nichols Houston株、Nichols Seattle株、Nichols Dallas株、Dal-1株、MexicoA株、Bal73-1株、Seattle81-4株以及SS14株进行Tp0136 DNA测序和氨基酸序列对比研究，结果也支持上述观点。

Tp0136可与血浆纤连蛋白(fibronectin,Fn)、细胞纤连蛋白及超纤连蛋白发生有效结合[14]。与血浆Fn的主要作用位点在Tp0136的NH2端保守区；而与细胞Fn，除了NH2端外，还可通过羧基端和中部进行相互作用，故Tp0136与细胞Fn的结合更有效[15]。Tp0136与Fn相互作用的分子机制尚需深入研究。Brinkman等[14]用Nichols株接种实验兔，14天后，实验兔血清即可与rTp0136以及TP蛋白溶解产物发生反应(即血清中产生了抗Tp0136抗体)，说明Tp0136具有一定的免疫原性。实验中Tp0136还可被梅毒兔血清及早期梅毒患者阳性血清所识别[16,17]，故Tp0136具有免疫反应性，可能在梅毒早期诊断中具有潜在价值。Brinkman等[14]发现，用rTp0136免疫新西兰兔，再用Nichols株感染时，可显著延迟溃疡出现的时间，减轻皮损，但并不能阻止感染的发生，说明Tp0136具有不完全的免疫保护作用。Ke等[15]为了探究梅毒感染过程中Tp0136 mRNA的转录情况是否会发生变化，对实验兔初期皮损中Tp0136 mRNA进行定量了分析，在感染后6～18天 Tp0136 mRNA转录水平持续而稳定，在21～30天(硬下疳愈合期)转录水平较前增加，尤其在感染后第27～30天增加最为显著。Tp0136 mRNA在感染早期持续高转录，并在硬下疳愈合期间明显升高，即Tp0136的转录与宿主免疫压力相平行，这可能与TP的持续感染能力有关。

2 Tp0155和Tp0483

Cameron等[18]对Tp基因组进行生物信息学分析，推测Tp0155和Tp0483可能具有黏附功能，并通过实验证实二者均可与Fn发生特异性结合，其中Tp0155优先与细胞外基质中Fn结合，而Tp0483既能结合血浆可溶性Fn及细胞外基质Fn，还能与分泌Fn的哺乳动物细胞结合；抗Tp0155和抗Tp0483特异性抗体可部分阻断TP与纤连蛋白包被的显微载玻片的黏附。这种黏附作用可能有助于TP隐藏自身表面抗原，从而逃避宿主免疫系统的识别，达到快速增殖与扩散的目的。

为探究Tp0483与Fn结合的机制及影响因素，Dickerson等[19]用自组装单分子膜(Self-assembled monolayers,SAMs)技术模拟了Tp0483与Fn结合情况，结果显示，与-OHSAMs、-NH3SAMs、-CH3SAMs相比，-COO-SAMs所结合的Tp0483显著增多，但Tp0483-COO-SAMs所结合的Fn与Tp0483的量却不成正比。Dickerson等用表面等离子反应(Surface plasmon response,SPR)实验进一步证实了这一结果，由此认为Tp0483与Fn的结合可能与二者表面所带电荷及化学基团性质有关。

Tomson等[20]试图用间接免疫荧光法探究Tp0155和Tp0183的细胞膜定位，但并未找到二者位于TP外膜表面的证据，认为这与Tp0155和Tp0483具有黏附功能相矛盾，故推测二者可能并非真正的外膜蛋白。用rTp0155和rTp0483分别免疫新西兰兔，虽然可产生高滴度特异性抗体，但均不能阻止再感染时皮损的发生，故二者虽有免疫原性，但均不具有免疫保护作用。

3 Tp0751

Tp0751基因全长714 bp，编码237个氨基酸。它是由一条多肽链构成的蛋白质，其三级结构的核心是一个位于C端、由8条反向平行排列的β链构成的β桶状结构[21]。功能研究发现，Tp0751是一个具有双重功能的Tp膜蛋白：一方面，它能与层黏连蛋白(基底膜重要成分)及纤维蛋白原发生特异性结合；另一方面，Tp0751还具有金属蛋白酶活性[22,23]。氨基酸序列分析证实其C端含有一个HEXXH金属蛋白酶模体，能够结合锌离子，是一个锌离子依赖的、膜相关的金属蛋白酶，依靠其金属蛋白酶活性，Tp0751可降解与之结合的层黏连蛋白和纤维蛋白原[23]。Houston等[22]在研究中发现，对HEXXH进行定点突变可使Tp0751失去对宿主组织的蛋白水解作用，但不影响其与组织的黏附，故推测Tp0751对组织的黏附作用和蛋白水解作用在结构和功能上可能都是相互独立的。Houston等[22]对Tp0751蛋白水解机制进一步研究发现，其N端存在凝血酶裂解位点和自身催化裂解位点，可通过宿主凝血酶介导的催化裂解和自身催化裂解两种途径获得完整的金属蛋白酶活性。前一种途径可能是TP在进化过程中形成的特殊的基因节约方式，而后一种途径则能保证Tp0751即使是在凝血酶极少情况下(如骨骼、神经等)，其蛋白水解活性也能被有效激活，故而Tp可以在机体内长期持续存在，并能侵袭全身多种组织和器官。柯等[24]用梅毒兔模型探究Tp0751蛋白在早期皮损中转录情况时发现，标准化Tp0751(以Tp管家基因Tp0574作为Tp0751标准化的参比基因)转录水平在Tp被清除后期出现全身播散性二期梅毒疹前高表达，这可能是Tp为了对抗宿主对其清除作用，通过高度表达Tp0751蛋白降解层黏连蛋白和纤维蛋白原，进而实现在宿主体内的播散。说明Tp0751可能参与了TP的播散。

Liu等[25]通过基因工程方法制备并纯化Tp0751重组蛋白(rTp0751)，用Western blot对其进行检测分析发现，rTp0751不仅能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应，还能刺激新西兰兔产生高效价特异性抗体，即Tp0751重组蛋白具有良好的免疫原性。另外Tp0751还可能有促炎作用。rTp0751可通过THP-1单核细胞膜上TLR2和CD14激活MAPKs/p38和NF-κB两种途径，进而诱导THP-1产生TNF-α、IL-1β和IL-6等前炎症细胞因子[25]。因此，Tp0751可能是一个重要的致病因子。

4 Tp0750

Tp0750是近年新发现具有黏附功能的TP膜蛋白，它与Tp0751在结构和功能上密切相关。分析Tp0750和Tp0751基因序列发现，二者在同一条DNA链上同向排列,位于同一阅读框内，且存在基因共转录现象，故推测二者可能是以异源二聚体复合物的形式暴露于Tp表面[26]，但这一推测尚需进一步研究证实。与Tp0751相似，Tp0750也具有多种功能[26]：1)它可与纤维蛋白原发生特异型结合；2)具有基质金属蛋白酶样作用，可促进宿主细胞外基质降解，从而有利于TP在组织间的侵袭和播散；3)具有丝氨酸蛋白酶活性，可直接降解凝血瀑布中的重要成分——纤维蛋白原和纤连蛋白，从而抑制血栓形成；4)可与内皮细胞表面纤溶复合物受体——膜联蛋白A2结合，间接激活并促进纤溶。通过3)、4)两方面的作用，Tp0750可降解使感染局限的血栓，最终Tp可随血流发生广泛播散。

Houston等[27]对不同螺旋体Tp0750和Tp0751同源物氨基酸序列进行对比研究，发现Tp0750氨基酸序列与高侵袭性的T.paraluiscuniculi(兔梅毒密螺旋体，可致兔梅毒)同源物几乎完全相同，在弱侵袭性螺旋体中也具有较高的序列保守性，但在非致病性螺旋体中低度保守或消失。而Tp0751则仅在高侵袭性的T.paraluiscuniculi中高度保守。在体外黏附及蛋白水解实验中，Tp0750和Tp0751对纤维蛋白原、纤连蛋白及层黏连蛋白均表现出黏附及蛋白水解功能，而在低侵袭性和非侵袭性螺旋体中Tp0750和Tp0751同源物则不具有这两种功能，故Tp0751和Tp0750的黏附及蛋白水解功能可能与侵袭作用有关。

5 Tp0435

Tp0435(或Tp17)开放阅读框包含468个碱基对，编码156个氨基酸，分子量约17KDa[28]。晶体结构研究显示，Tp0435是一个由8条反向平行排列的β链组成的桶状结构，一端呈浅“盆”状，另一端由一个α螺旋覆盖。Tp0435在还原状态下为单体形式，在氧化状态下以一个二硫键连接的二聚体形式存在。Brautigam等[29]推测Tp0435可能在Tp细胞周质间隙发挥氧化还原感受器的作用，并且可能通过改变自身氧化还原状态与下游的效应分子进行信号传递。但这一假说尚未得到证实。在蛋白功能方面，以往研究发现，它可与梅毒患者血清发生强烈反应[30-32]，故Tp0435与其他TP膜蛋白(如TPN47)被应用于梅毒诊断[33]。此外，Tp0435也是一种炎症介质，可刺激巨噬细胞产生TNF-α[28]，还能活化人脐静脉内皮细胞，上调细胞间黏附分子(ICAM-1)、E选择素(E-selectin)以及单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的表达与基因转录，促进单核细胞迁移及与内皮细胞的黏附，故Tp0435可能在梅毒免疫方面发挥重要作用[34]。

除上述作用外，最近Chan等[35]还发现Tp0435具有黏附功能。通过构建Tp0435重组表达体，使其在伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi)中得到有效表达。实验中观察到，B.burgdorferi经长时间体外培养后可丢失内源性质粒而失去黏附能力，但成功表达rTp0435的B.burgdorferi却能重新与人胚肾上皮细胞、胎盘细胞和神经胶质瘤细胞结合，这一结果表明rTp0435可能参与TP和多种宿主细胞的黏附。

Tp0435是一种膜脂蛋白，关于其在TP细胞膜上的定位目前存在争议。有学者认为它暴露于外膜表面，也有人认为它只存在与细胞周质间隙。Chan等[35]用间接荧光抗体法检测了B.burgdorferi表面表达的rTp0435，再对细胞进行透化处理，发现荧光强度较处理前增强了2～3倍。因此Chan等提出了与上述不同的观点：rTp0435可能只有小部分暴露于Tp外膜表面，而大部分定位于细胞周质间隙。

Chan等[35]还发现，表达于B.burgdorferi表面的Tp0435蛋白存在多种亚型，并且只能在一部分B.burgdorferi和T.pallidum菌体表面检测到Tp0435，即Tp0435在菌体外膜表面的分布具有随意性的特点。Chan等认为这些蛋白亚型可能是由相同的Tp0435蛋白质前体经不同的翻译后加工形成的。Tp0435的翻译后加工可能在每个螺旋体中都是独立且随机进行的，新合成的Tp0435经加工处理后，随意分布于细胞周质间隙和外膜表面，或者只分布于细胞周质间隙。然而Tp0435在细胞中的分布差异最终可能导致Tp在机体中不同的结局：在感染早期，适应性免疫应答尚未建立，表面表达Tp0435的梅毒螺旋体可与宿主多种细胞发生黏附，而针对Tp0435的特异性免疫应答建立以后，表面表达Tp0435的游离Tp则被清除，只有表面缺乏Tp0435的Tp才能在播散过程中存活下来，并在机体中持续存在，这是发展为晚期梅毒的必要条件。

6 结语

梅毒目前仍然是全球面临的严重的公共卫生问题。由于Tp无法在体外连续培养、基因操作困难、细胞膜易碎难以提取等，使得Tp膜蛋白的鉴定和研究严重受阻。Tp黏附蛋白与侵袭力密切相关，对其生物学功能和结构的深入探究，将有助于阐明Tp致病机制及宿主免疫应答机制，有助于优化梅毒的诊断方法，同时也为开发有效的梅毒疫苗提供依据。