兔病毒性出血症重组杆状病毒HP-VP60的构建及鉴定

龚文波，田丽梅，于作，古静，方鹏飞

（华派生物工程集团有限公司，四川 简阳 641400）

兔出血症（RHD）俗称兔瘟，是一种急性、烈性、高度接触性传染病，以呼吸系统出血和实质器官水肿、淤血及出血性变化为特征，可引起兔群大批发病和死亡[1]。RHD病毒基因组中的主要结构蛋白VP60是病毒的免疫保护性抗原，在诱导抗病毒感染的免疫反应中起重要作用[2]。本研究利用Bac-to-Bac系统构建了表达RHDV LQ株VP60蛋白的重组杆状病毒HP-VP60，并对其表达产物的血凝效价及免疫原性等进行鉴定，结果显示该重组杆状病毒的表达产物具有良好的免疫原性，可用于制备RHDV亚单位疫苗。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌种和细胞 pT-VP60质粒（含有RHDV LQ株VP60基因）由华派生物质检研发中心构建；pFastBacDual杆状病毒转移载体、DH10Bac感受态细胞和Sf9细胞由华派生物质检研发中心保存。

1.2 主要试剂 DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、醋酸纤维素膜（NC膜）购自天根生化科技有限公司；ExTaq DNA 聚合酶、DNA Marker、T4 DNA 连接酶以及其他限制性内切酶均购自大连宝生物工程有限公司；DNA-RNA共提取试剂盒和RHDV兔高免血清由华派生物质检研发中心自制；HRP标记的羊抗兔IgG抗体、FITC标记的羊抗兔IgG抗体购自Sigma公司；转染试剂Lipofectamine 2000、胎牛血清购于Thermo Fisher公司；SF-SFM培养基购自苏州市沃美生物技术有限公司。

1.3 引物的设计与合成 本文引物序列见表1，由上海英潍捷基有限公司合成。

表1 引物序列

1.4 VP60基因的扩增与克隆 分别用VP60F1/VP60R1引物和VP60F2/VP60R2引物，以pT-VP60质粒为模板进行PCR反应，扩增出VP60/EH和VP60/KN基因片段，然后克隆入pMD19-T载体上，经菌落PCR及相应酶切鉴定后，将阳性质粒送上海英潍捷基有限公司测序，鉴定正确的质粒命名为pTVP60/EH和pT-VP60/KN。

1.5 重组杆粒Bac-VP60的构建 用EcoRI和HindIII双酶切pFastBacDual和pT-VP60/EH质粒，将VP60基因克隆入pFastBacDual载体上，构建重组质粒pFastBacDual-VP60。然后再通过NheI和KpnI双酶切将VP60基因克隆入pFastBacDual-VP60上，所得到的重组质粒命名为pFastBacDual-2VP60。用pFastBacDual-2VP60质粒转化DH10Bac感受态细胞，再涂布到LB-Bac平板（含有50μg/mL卡那霉素、7μg/mL庆大霉素、10μg/mL四环霉素、100μg/mL X-gal和 40μg/mL IPTG），37℃培养 48h。挑取白色单菌落，重新划线于LB-Bac平板，37℃培养24h后，再挑取白色单菌落接种于LB-Bac液体培养基（含有50 μg/mL 卡那霉素、7 μg/mL 庆大霉素、10 μg/mL 四环霉素），37℃振荡培养过夜。提取重组杆粒分别用P10F/P10R、PH-Profor/SV40-PArev和 VP60F1/VP60R1引物进行PCR鉴定，鉴定正确的重组杆粒命名为Bac-VP60。

1.6 重组杆状病毒HP-VP60的获得及传代 参照转染试剂Lipofectamine 2000说明书，将重组杆粒Bac-VP60转染Sf9细胞，转染后每日观察细胞形态，待细胞出现直径变大、产生泡状物、脱落等明显病变时收获细胞培养物，以2620r/min离心5min，收获上清即为重组杆状病毒母液（F0代病毒），命名为HPVP60。将F0代病毒液以1%体积比接种Sf9细胞，接毒后72～96h收获细胞培养物，以2620r/min离心5min，收获上清即为F1代病毒，分装后短期可于4℃避光保存，长期应于-70℃保存。

1.7 重组杆状病毒HP-VP60的鉴定 根据DNARNA共提取试剂盒说明书提取重组杆状病毒HPVP60的基因组DNA，用VP60F1和VP60R1引物进行PCR反应。PCR反应体系为：基因组DNA 2.5μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，10mM dNTP 2.5μL，Ex Taq 1μL，上下游引物各 1μL，ddH2O 37μL。反应程序为：93℃ 3 min，94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 2 min，30 个循环；72℃ 10min。

1.8 IFA检测重组杆状病毒表达产物 在96孔细胞培养板上，将F1代重组杆状病毒HP-VP60接种到对数生长期的Sf9细胞，培养至产生病变时进行IFA检测，同时设未接毒的正常Sf9细胞作对照。操作步骤如下：吸弃96孔板中的培养液，用1×PBS洗2次，加入-20℃预冷的无水乙醇于室温下固定30 min；再用1×PBS洗3次，加入1∶50倍稀释的兔RHDV高免血清，37℃作用1h；1×PBS洗3次，加入1∶100倍稀释的FITC标记的山羊抗兔IgG，37℃下避光作用1h；1×PBS避光洗3次，然后置于荧光显微镜下观察并拍照。

1.9 Western Blot法检测重组杆状病毒表达产物 将收获的F1代病毒液感染Sf9细胞，72h后收获上清进行SDS-PAGE电泳，同时以感染非重组野生型杆状病毒的Sf9细胞以及未被感染重组杆状病毒的Sf9细胞作为阴性对照和空白对照，然后转印至醋酸纤维素膜（NC膜），用5%脱脂奶粉封闭过夜。用1×TBST洗涤3次，加入1∶100倍稀释的RHDV兔高免血清，37℃作用1h；用1×TBST洗涤3次，加入1∶2 000倍稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，37℃作用1h；1×TBST洗3次，然后用DAB显色、观察。

1.10 电镜观察 将收获的病毒液进行蔗糖密度梯度超速离心，取纯化的病毒样颗粒，用2%磷钨酸钠溶液负染，电镜下观察。

1.11 表达蛋白的血凝效价测定 在96孔“V”形血凝板中每孔先加入50μL灭菌生理盐水，然后在第1孔内分别加入50μL感染重组病毒的细胞培养物，混匀后，吸取50μL加入到第2孔中，如此连续稀释至第11孔，第11孔吸取50μL液体弃掉；第12孔为灭菌生理盐水对照，阴性细胞培养物按相同方法稀释；然后每孔加入50 μL 1%的人O型红细胞悬液，混匀，37℃下作用30min后观察结果。

1.12 表达蛋白的免疫原性测定 将收获的病毒液上清，经二乙烯亚胺（BEI）灭活后，制备成氢氧化铝胶灭活疫苗，接种10只1.5～3.0kg健康易感家兔，每只颈部皮下注射0.5mL。14日后，将10只免疫兔与10只同条件、同来源的对照兔，分别颈部皮下注射1∶9稀释的兔病毒性出血症病毒（肝、脾毒）1.0mL，攻毒后连续观察7d，记录家兔死亡情况。

2 结果与分析

2.1 重组杆状病毒HP-VP60鉴定 提取重组病毒基因组DNA，以VP60F1和VP60R1引物进行PCR鉴定，结果得到一条1740 bp电泳条带（图1），与目的基因大小一致，说明VP60基因已经整合入重组杆状病毒基因组中。

图1 PCR鉴定重组杆状病毒HP-VP60凝胶电泳图

2.2 重组杆状病毒HP-VP60表达产物的IFA鉴定 IFA鉴定结果显示：感染重组杆状病毒的细胞具有很强的特异性荧光，而作为阴性对照的正常Sf9昆虫细胞无特异性荧光出现，说明VP60蛋白得到了表达。

2.3 重组杆状病毒HP-VP60表达产物的Western Blot鉴定 对F1代病毒感染Sf9细胞72h后收获的上清进行Western Blot分析，结果在60kDa处出现明显的目的蛋白条带，而感染非重组野生型杆状病毒的Sf9细胞悬液和正常Sf9细胞悬液均无条带出现。说明VP60蛋白在Sf9细胞中成功表达。

2.4 电镜检测 电镜下可见大小约35～40 nm的病毒样颗粒，与RHDV病毒粒子大小相当、形态学相近。

2.5 表达蛋白的血凝效价测定 血凝试验结果显示：重组杆状病毒HP-VP60的表达产物能凝集人O型红细胞悬液，血凝效价为1∶4096。

2.6 免疫原性检测 将收获的病毒液上清灭活，制备氢氧化铝胶灭活疫苗，进行家兔攻毒保护实验。结果显示：免疫组家兔100%保护，对照组家兔全部死亡（表2），表明构建的重组杆状病毒HP-VP60表达产物具有良好的免疫原性。

表2 免疫原性试验结果

3 小结

RHDV不能在鸡胚上增殖，也难于在各种原代或传代细胞中稳定增殖。目前广泛使用的疫苗为组织灭活苗。近年来，新型疫苗的研究主要集中在基因工程疫苗的研制上，现已在大肠杆菌、酿酒酵母、痘苗病毒以及植物等多种表达系统中表达了VP60蛋白[3-5]。但是，目前RHDV基因工程疫苗研究中仍然存在一些问题：大肠杆菌表达的VP60蛋白以包涵体形式存在，具有不可溶性和免疫效果较差的缺点，应用前景并不乐观；重组病毒疫苗存在向环境扩散经遗传修饰的生物安全问题；采用转基因植物生产VP60的表达水平目前还不理想。因此，研制RHD安全、高效的新型疫苗势在必行。

昆虫杆状病毒表达系统的表达效率高，表达的蛋白抗原性、免疫原性均与天然蛋白相似，生物活性较强，并且可以实现全悬浮培养，利用该系统表达外源蛋白，经济、高效。本研究利用昆虫杆状病毒Bacto-Bac系统构建重组杆状病毒HP-VP60，用该重组杆状病毒感染Sf9细胞后能够表达出VP60蛋白，且在细胞内能自动组装成病毒样颗粒（VLP）。将表达出的VLP制备成疫苗后免疫家兔，能够100%保护家兔免受强毒攻击。

[1] 李岳余，张立颖.兔病毒性出血症的防治[J].中国动物保健，2016，18（3）：27-28.

[2] 于新友，李天芝，莫玲，等.兔病毒性出血症病毒分子生物学研究进展[J].中国养兔，2016（1）：32-36.

[3] Boga J A，Casais R，Marin M S，et al.Molecular cloning，sequencing and expression inEscherichia coliof the capsid protein gene form rabbit haemorrhagic disease virus（Spanish isolate AST/89）[J].J General Virol，1994，75（9）：2409-2413.

[4] 张夏兰，王红宁，张昌菊，等.兔病毒性出血症基因工程疫苗的研究进展[J].中国预防兽医学报，2007，29（10）：821-824.

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