咖啡树咖啡碱合成相关基因研究进展

李梅 徐丹旎 李丽江 尚卫琼 李旸 尚宇梅

摘 要 咖啡是世界三大饮料之一，其含有的咖啡碱，适量摄入对身体有益，过多则有害。因此，培育低咖啡碱或无咖啡碱咖啡品种具有非常重要的意义。目前，已从多数植物中分离并克隆出咖啡碱合成的相关基因，并研究了其表达特点和相关酶活性的调节机制，探讨培育低咖啡碱咖啡树的可能途径和存在的问题。综述近年来咖啡树咖啡碱合成与代谢的研究进展，展望如何培育出生长快、成本低、安全稳定的低咖啡碱植株，从而实现农业推广。

关键词 咖啡树 ；咖啡碱 ；基因

中图分类号 S571.2 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.09.009

Abstract Coffee was one of the three major beverages in the world. Coffee contains caffeine， and is good to the health when taken adequately but harmful when taken too much. It is， therefore， very important to breed low caffeine or caffeine-free coffee varieties. The genes related to caffeine synthesis had been isolated and cloned from most of plants， and their expression and regulatory mechanisms underlying the activities of related enzymes had been analyzed. The problems and ways of breeding low caffeine or caffeine-free coffee varieties were discussed. The research progress of caffeine synthesis and metabolism in recent years were reviewed， based on which a prospect was made for breeding and extension of low caffeine coffee varieties with fast growth， low cost， safety and stability.

Keywords coffee tree ； caffeine ； genes

咖啡是重要的热带经济作物，是世界三大饮料之一，在国际贸易、热带农业经济和人类生活中具有重要作用。咖啡为茜草科（Rubiaceae）咖啡属（Coffea genus）植物，该属植物共100多种，主要分为四倍体和二倍体[1]。目前，主要种植的有小粒种（Coffee arabica）、中粒种（Coffee robusta）和大粒种（Coffee liberica）[2-4]。小粒咖啡的大多数品种中，咖啡豆中咖啡碱含量约为1.0%，中粒咖啡为1.7%，大粒咖啡为1.4%[5]。其中，小粒种咖啡品质较好，种植面积大，其产量占全球咖啡产量的73%。目前，小粒咖啡较为常见的品种有波邦（Bourbon）、铁毕卡（Typica）、卡杜拉（Caturra）、卡蒂姆（Catimor）、卡杜艾（Catuai）等[2]。近年来，小粒种咖啡生产规模不断扩大，产业发展迅速，已成为很多地区独具优势的特色经济和支撑产业。国内越来越多的人接受并饮用咖啡，咖啡含有咖啡碱，适量摄入对身体有益，过多则有害。在小粒咖啡中，咖啡碱的合成部位主要在叶片和鲜果中，幼苗的叶片和子叶含有咖啡碱，而根部和成熟枝条中几乎不含有咖啡碱[6]。

咖啡碱（Caffeine）又称咖啡因或甲基可可碱，是一种黄嘌呤生物碱化合物，其化学名为1，3，7-三甲基黄嘌呤，化学式为C8H10N4O2[7]。植物中，咖啡碱的合成代谢途径主要分为4步反应，包括3次由甲基转移酶催化进行的甲基化反应和1次由核糖核苷水解酶催化进行的脱核糖反应[8]。目前，从咖啡树中，已克隆得到 3 个咖啡碱合成的关键酶基因，分别为咖啡7-黄嘌呤核苷甲基转移酶（7-Methylxanthosine Synthase，CaXMTT1）[9]，咖啡碱合成酶基因（Coffee Caffeine Synthase，CaDXMT1）[10]和双功能酶基因（Bifunctional Coffeee Coffeine Synthase，CCS1）[11]。但是目前对小粒咖啡树不同部位中CaXMT1、CaDXMT1、CCS1基因表达量差异，以及这3个关键基因的表达与咖啡碱含量关系的研究尚无报道。

1 咖啡碱的作用

咖啡碱存在于许多植物中，人类最常食用的有咖啡、茶及可可等。咖啡碱是一种中枢神经兴奋剂，适度摄入可以兴奋神经中枢，提高反应速度、集中注意力和消除疲劳[12-14]；能够促进胰岛素分泌和降低Ⅱ型糖尿病风险，刺激呼吸系统，用于治疗早产婴儿呼吸暂停[15-17]。摄入过量的咖啡碱，会对人体产生负作用，使人体对其产生依赖性或成瘾，引起机体功能失调，甚至引发各种疾病。研究表明，摄入高剂量的咖啡碱会影响睡眠、刺激中枢神经、提高类风湿关节炎的患病率、增高血压以及引起孕妇婴儿早产等现象[18-20]。由于以上这些咖啡碱的负面作用，国内及国际市场上，都希望有低咖啡碱或无咖啡碱的咖啡和咖啡饮品。近年来，咖啡生产商都在努力的降低和去除咖啡中的咖啡堿，但去除咖啡碱的同时，又保证其它成分完好无缺是一个非常大的挑战。市场上诸多去除咖啡咖啡碱的方法，不仅破坏了咖啡原有的风味，而且成本较高，但脱咖啡碱咖啡每年的市值仍然高达20亿美元。

2 咖啡碱的合成途径

20世纪60年代至70年代初，通过放射性标记的研究，观察咖啡组织中的转移动态，初步确定可可碱（theobromine， 3，7-二甲基黄嘌呤，Tb）是咖啡碱合成的直接前体物质。在咖啡树叶片中，7-甲基黄嘌呤核苷（7-methylxanthosine， 7mXR）的放射性能转移到咖啡碱中。Suzuki等[21]在咖啡树愈伤组织提取物中检测到N-核苷水解酶和N-甲基转移酶活性，证明了合成咖啡碱的前体是7mXR。研究利用RACE技术和探针筛选法等，一系列咖啡碱合成酶基因分别被克隆出，包括咖啡7-黄嘌呤核苷甲基转移酶（7-Methylxanthosine Synthase， CaXMT1），可可堿合成酶基因（Coffee Theobromine Synthase，CaMXMT1）、CaMXMT2，咖啡碱合成酶基因（Coffee Caffeine Synthase， CaDXMT1）和双功能酶基因（Bifunctional Coffee Coffeine Synthase， CCS1）等[9-11]。虽然以上酶的氨基酸序列相似性达80%以上，但底物专一性的差异却较大。2007年，法国学者克隆到中果咖啡（Coffea canephora）的N-甲基转移酶CcXMT1和CcDXMT1基因，通过在大肠杆菌中表达并进一步纯化结晶，最后通过X射线衍射等方法，分析得到三维结构[22]。但是目前对小粒咖啡树不同部位中CaXMT1、CaDXMT1、CCS1基因表达量差异，以及这3个关键基因的表达与咖啡碱含量关系的研究尚无报道。

植物中，咖啡碱的合成代谢途径主要分为4步反应，包括：1次核糖核苷水解酶催化进行的脱核糖反应，3次甲基转移酶催化进行的甲基化反应。具体合成途径为：腺嘌呤→腺苷酸（AMP）→次黄嘌呤核苷酸（IMP）→黄嘌呤核苷酸（XMP）→黄嘌呤核苷（XR）→7-甲基黄嘌呤核苷（7mXR）→7-甲基黄嘌呤（7-MX）→可可碱（3，7-二甲基黄嘌呤）→咖啡碱（1，3，7-三甲基黄嘌呤，Cf）[22]。N-甲基转移酶（N-Methyltransferase，NMT）是催化三步转甲基反应的关键[23-24]。

咖啡碱合成途径中以黄嘌呤核苷为底物，生成7-甲基黄嘌呤核苷，是第一步反应。Uefuji等[9]从咖啡中克隆出编码7mXR合成酶的cDNA序列，命名为 CaXMT1。根据McCarthy等[20]关于蛋白酶化学结构的研究发现，咖啡中的 CaXMT1 极有可能具有双重作用，同时催化黄嘌呤核苷进行了7-甲基转移以及核糖消解作用。

咖啡碱合成第二步反应的关键酶为：催化7mXR反应生成7-MX的核糖核苷水解酶。Negishi等[25]从茶叶粗酶中初步分离出茶树的核糖核苷水解酶，该酶在水解7-甲基黄嘌呤核苷时，所产生的D-核糖其5′-末端未被磷酸化，证明不是核苷磷酸化酶。尽管研究已检测到茶树中核糖核苷水解酶的生物活性，但目前有关该酶的具体蛋白表达及功能鉴定，不管在咖啡、茶叶还是其它植物中，尚无任何报道。

咖啡碱合成途径的最后两步反应，同样由甲基转移酶催化完成。在茶树中，Kato等[26]分离得到咖啡碱合酶（Caffeine Synthase， CS）；之后应用RACE方法，克隆出咖啡碱合成酶基因，全长为1 438 bp，正式命名为茶树咖啡碱合酶（Tea Caffeine Synthase，TCS）基因TCS1[27]，随后研究证实，TCS1具有可可碱合成酶和咖啡碱合成酶的双重作用。基于茶树TCS1的序列信息，在咖啡中，已克隆成功编码咖啡碱合成酶的基因CaDXMT1和CCS1，其中CCS1的活性与TCS1很相似。

此外，茶树中的次黄嘌呤核苷酸脱氢酶（Inosine 5′-Monophosphate Dehydrogenase；IMPDH）催化IMP合成XMP[28]，其cDNA全长序列被克隆，命名为TIDH。茶树中S-腺苷甲硫氨酸（SAM）合成酶基因（SAMs）也已被克隆，序列全长1 303 bp，编码394个氨基酸[29]。SAMS催化甲硫氨酸和ATP生成SAM，而SAM是茶树咖啡碱合成的唯一甲基供体。

Keya等[30]利用IMPDH抑制剂三氮唑核苷（ribavirin）降低了咖啡叶片中咖啡碱和可可碱的含量。Ogita等[31]通过利用 RNA 干扰技术，抑制咖啡植株中可可碱合成酶基因 CaMXMT1的表达，从而获得了低咖啡碱含量和低可可碱含量的转基因咖啡树。

Denoeud等[32]获取了中粒种咖啡的基因组草图，鉴别出中粒种咖啡基因组中合成超过 25 000 种蛋白质的基因。并且研究者还找到了使咖啡树中咖啡碱的含量高于其它植物的基因家族。研究人员发现，这些基因编码了甲基转移酶，从而在基因表达的过程中，增加甲基团，从而将一种黄嘌呤核苷分子转化为咖啡碱。此外，咖啡植株中与咖啡碱合成途径有关的酶，与茶树和可可植株合成途径中的酶并不相似，这说明三者合成咖啡碱的途径可能是独自演化而成。此外，与其它植物相比，咖啡植株的基因更易生成与咖啡的香味和苦味等密切相关的类黄酮和生物碱这2种物质。

3 培育低咖啡碱咖啡树品种的展望

研究人员在非洲发现了咖啡因含量仅为0.07%的咖啡树，该咖啡树缺少合成咖啡因所需的酶。但其生长速度比普通咖啡树品种慢30%左右。研究人员希望将它与普通咖啡树品种杂交来提高其生长速度，希望最终能培育出生长快、成本低、能大量生产上述咖啡豆的咖啡树。研究者利用RNA干扰技术，抑制了转基因胚胎细胞和植株幼苗中相关基因的表达，从而降低了其可可碱和咖啡碱的含量。此外，目前对于咖啡碱合成途径中相关基因表达特点，以及相关酶活性的调节机制已有相关报道，但其内在调控机制还处于未知状态，仍需新的研究手段和方法，同时，需要对其稳定性、安全性以及经济价值做出评价。

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