假连翘提取物对胡椒瘟病菌抑菌活性测定

苟亚峰 孙世伟 高圣风 孟倩倩 王政 刘爱勤

摘 要 测定假连翘提取物对胡椒瘟病菌菌丝生长、孢子萌发的抑菌活性及其对胡椒瘟病的防治效果。结果表明：10 mg/mL的假连翘提取物对胡椒瘟病菌菌丝生长的抑菌率达到100%，EC50为1.495 1 mg/mL，对孢子萌发的抑制率达到62.41%。当假连翘提取物稀释50倍时，对盆栽胡椒瘟病的保护效果达到77.55%，治疗效果较低。可见，假连翘用于防治胡椒瘟病具有较大的开发利用价值。

关键词 假连翘 ；提取物 ；胡椒瘟病菌 ；抑菌活性 ；防治效果

中图分类号 S567.19 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.09.010

Abstract Antifungal activity of Duranta repens extracts against mycelium growth and spore germination of Phytophthora capsici and its control efficacy were determined. The results showed that when P. capsici was treated with the D. repens extracts at a concentration of 10 mg/mL the mycelium growth of P. capsici was inhibited by 100%， with EC50 being 1.495 1 mg/mL， while the spore germination of P. capsici was inhibited by 62.41%. When the D. repens extracts were diluted by 50 times， and the control efficacy was 77.55%. The D. repens extracts had a high potential in development into a fungicide for control of P. capsici.

Keywords Duranta repens ； extracts ； Phytophthora capsici ； pathogen inhibitory activity ； control efficacy

胡椒瘟病又稱胡椒茎（基）腐病，是由辣椒疫霉（Phytophthora capsici Leonian）侵染引起的一种传染力很强的土传性病害，胡椒瘟病一直是威胁胡椒产业发展的首要病害[1-2]。在高温多雨季节，病情严重的胡椒园损失率达90%以上[3-4]。国内目前生产上用于防治由Phytophthora capsici引起的疫病主要以甲霜灵、三乙磷酸铝、敌克松、杀毒矾等化学药剂防治为主。由于长期使用化学农药，不仅容易引起抗药性，而且容易破坏胡椒园的生态环境和降低胡椒的品质[5-6]。国外Demirci[7]测定了大蒜、薄荷、卷心菜、苜蓿等乙醇提取物对胡椒瘟病的防治效果，其中，卷心菜乙醇提取物对大田胡椒瘟病的防效达到89.5%。Ezziyyani等[8]利用哈茨木霉（Trichoderma harzianum）和娄彻氏链霉菌（Streptomyces rochei）对胡椒瘟病进行了生物防治研究。

前期研究发现，假连翘（Duranta repens Linn.）、圆滑番荔枝（Annona glabra Linn.）、蔓马缨丹（Lantana montevidensis Briq.）等乙醇提取物对胡椒瘟病菌菌丝生长具有较好的抑菌效果。假连翘为马鞭草科植物，我国南方常见栽培或逸为野生，原产热带美洲，具有截疟，活血止痛之功效。目前，假连翘用于防治虫害的研究很多。赖建辉[9]等研究表明，15%烟碱、草提取物和假连翘提取物中含有对黄曲条跳甲种群明显起忌避作用的活性物质。徐武兵[10]等研究发现，金叶假连翘对福寿螺有一定的驱赶作用。但对假连翘提取物中具体的生物活性成分还未见报道。因此，本研究进一步测定了假连翘乙醇提取物对胡椒瘟病菌的抑菌活性，为下一步分离抑制胡椒瘟病菌的活性成分奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料

假连翘枝叶采于中国热带农业科学院香料饮料研究所。将新鲜的假连翘枝叶充分阴干，磨碎，过40目筛后，置通风、避光处储藏，备用。

1.1.2 供试病原菌

胡椒瘟病菌（Phytophthora capsici）从发病胡椒瘟病叶片中分离得到。

1.2 方法

1.2.1 假连翘提取物的制备

准确称取一定量的假连翘枝叶干粉装入广口瓶中，加入干粉5倍量的乙醇浸提72 h，并将滤液减压浓缩，依次重复3次，合并3次的浓缩液，得假连翘提取物浸膏备用。

1.2.2 假连翘提取物对胡椒瘟病菌菌丝生长、孢子萌发的影响

参照黄艳飞等[11]操作方法进行，将假连翘提取物制备为100和50 mg/mL，以加入等体积萃取溶剂灭菌水的PDA培养平板为对照，每个处理做3个皿重复。接种后，在人工气候培养箱内，25～28℃下培养5 d，采用十字交叉法分别测量菌落直径，求其平均值，计算提取物对胡椒瘟病菌菌丝生长的抑菌率。

将假连翘提取物制备为20和10 mg/mL，将孢子悬浮液与供试的2种浓度按体积比为1∶1的比例混合均匀后，滴加1滴于灭菌的凹玻片上，28℃培养6～12 h，当对照的孢子萌发率达到80%以上时，在显微镜下检查200个孢子的萌发情况，计算提取物对胡椒瘟病菌孢子萌发的抑制率。

1.2.3 假连翘提取物对胡椒瘟病菌毒力（EC50）测定

将假连翘提取物稀释为5个浓度，按一定比例加入到融化好的PDA培养基中，参照1.2.2的方法测定，每处理重复3次，用最小二乘法计算毒力回归方程及抑制中浓度（EC50）。

1.2.4 假连翘提取物对活体胡椒瘟病防治效果测定

参照桑利伟等[12]的方法并进行改进，具体方法如下：采摘健康、新鲜、叶龄相同的胡椒嫩叶（直径不大于9 cm），洗净放于吸水纸上晾干；将假连翘提取物稀释为50X和100X，对照药剂烯酰·吗啉WP配制为2 000X和4 000X，以不含有效成分的空白作对照，共5个处理。保护作用测定方法：先于真叶上施药，晾干药液后，用昆虫针在叶子正面等距离的位置刺伤，再用接种针将3块直径为6 mm的病原菌菌落边缘菌饼接在相应刺伤处，每皿1片真叶，正面朝上放于培养皿中，然后于人工气候培养箱（25～28℃）中培养，5 d后测量各处理的病斑生长直径，按下式计算保护效果。

治疗作用测定方法：先于嫩叶上接种菌饼，放于人工气候培养箱（25～28℃）中培养2～3 d，测量各嫩叶上病斑生长直径d1后施药，施药后再置于培养箱中培养。接种第5天测量各处理的病斑生长直径d2，按下式计算治疗效果。

2 结果与分析

2.1 假连翘提取物对胡椒瘟病菌菌丝生长、孢子萌发的抑菌活性

假连翘提取物对胡椒瘟病菌菌丝生长和孢子萌发的抑制活性，结果见表1。

从表1可以看出，当假连翘提取物供试浓度为10 mg/mL时，对胡椒瘟病菌菌丝生长抑制率达到100%，孢子萌发抑制率达到62.41%；当供试浓度为5 mg/mL时，对胡椒瘟病菌菌丝生长抑制率达到86.87%，孢子萌发抑制率达到49.66%。可见，假连翘提取物对胡椒瘟病菌菌丝生长及孢子萌发均具有一定抑制作用。

2.2 假连翘提取物对胡椒瘟病菌的毒力

从表1中可以看出，假连翘提取物对胡椒瘟病菌表现出较强的抑菌活性。进一步测定不同浓度的假连翘提取物对胡椒瘟病菌菌丝生长的毒力（EC50），结果见表2。

从表2可以看出，假连翘提取物在相关系数为0.971 8时，对胡椒瘟病菌菌丝生长的EC50为1.495 1 mg/mL。

2.3 假连翘提取物对胡椒瘟病的防治效果

假连翘提取物对胡椒瘟病的防治效果见表3。

从表3中可以看出，假连翘提取物对胡椒瘟病的防治效果明显低于化学杀菌剂烯酰·吗啉WP。当假连翘提取物稀释50倍时，保护效果达到77.55%，治疗效果为37.06%，表现出较强的保护效果。在供试浓度下，对照化学杀菌剂烯酰·吗啉WP的保护效果和治疗效果均达到60%以上。

3 讨论

本试验结果表明，假连翘乙醇提取物对胡椒瘟病菌具有较好的抑菌活性。在供试质量浓度为10 mg/mL时，对胡椒瘟病菌菌丝生长抑菌率高达100%，EC50为1.495 1 mg/mL；对孢子萌发的抑制率为62.89%。组织法试验结果表明，假连翘提取物对胡椒瘟病的保護效果大于治疗效果，但均低于对照药剂烯酰·吗啉WP。有研究报道，植物源农药对病虫害的防治效果普遍低于化学药剂，但鉴于植物源农药对环境污染小，对作物靶标安全，不易产生抗药性等优点，随着国家越来越提倡绿色防控，植物源农药将会有广阔的发展前景。

据报道，Syuntaro Hiradate[13]等从假连翘中分离得到3种新的三萜皂甙类化合物，对芥菜幼苗生长具有抑制活性。Heminder Singh[14]等研究发现，5%假连翘水提液在温室条件下可以作为高粱霜霉病一种有前景的有机杀菌剂，并从中分离得到植物甾醇类化合物。以上研究报道与本研究中发现假连翘提取物对胡椒瘟病菌具有抑菌活性相一致，但具体的抑菌活性物质有待进一步分离。

参考文献

[1] 桑利伟，谭乐和，刘爱勤，等. 海南省胡椒主要病害现状初步调查[J]. 植物保护，2010，36（5）：133-138.

[2] 桑利伟，刘爱勤，谭乐和，等. 海南省胡椒瘟病病原鉴定及发生规律[J]. 植物保护，2011，37（6）：168-171.

[3] 桑利伟，刘爱勤，谭乐和，等. 胡椒瘟病田间发生规律观察[J]. 热带作物学报，2010，31（11）：1 996-1 999.

[4] 崔昌华，郑服丛，贺春萍，等. 海南胡椒主要真菌病害调查与病原鉴定[J]. 安徽农业科学，2011，39（6）：3 355-3 358.

[5] 戚仁德，丁建成，高智谋. 安徽省辣椒疫霉对甲霜灵的抗药性监测[J]. 植物保护学报，2008，35（3）：245-250.

[6] 赵卫松，韩秀英，齐永志，等. 辣椒疫霉对双炔酰菌胺的敏感性测定及其抗药突变体生物学形状研究[J]. 农药学学报，2011，13（1）：21-27.

[7] Demirci F， Dolar F S. Effect of Some Plant Materials on Phytophthora Blight（Phytophthora capsici Leon.） of Pepper[J]. Turk J Agric For， 2006， 30： 247-252.

[8] Ezziyyani M， Requena M E， Egea Gilabert C， et al. Biological control of Phytophthora root rot of pepper using Trichoderma harzianum and Streptomyces rochei in combination[J]. Journal of Phytopathology， 2007， 155（6）： 342-349.

[9] 赖建辉，赖荣泉，赖成连，等. 不同提取物对黄曲条跳甲种群的忌避作用及其保苗效果[J]. 云南农业大学学报，2012，27（4）：604-606，610.

[10] 徐武兵，钟秋华，李林峰，等. 16种植物对福寿螺的趋避效果研究[J]. 广东农业科学，2010，37（11）：149-152.

[11] 黄艳飞，汪汉成，陈庆元，等. 六种杀菌剂对烟草赤星病菌菌丝生长和分生孢子萌发的抑制作用[J]. 农药学学报，2016，18（2）：263-267.

[12] 桑利伟，刘爱勤，高圣风，等. 防治胡椒瘟病生物农药筛选及其盆栽药效试验[J]. 热带作物学报，2017，38 （5）：915-918.

[13] Hiradate S， Yada H， Ishii T， et al. Three plant growth inhibiting saponins from Duranta repens[J]. Phytochemistry， 1999， 52（7）： 1 223-1 228.

[14] Singh H， Zameer F， Khanum S A， et al. Durantol - a phytosterol antifungal contributor from Duranta repens， Linn. For organic Management of Sorghum Downy Mildew[J]. European Journal of Plant Pathology， 2016， 146（3）： 1-12.