分散固相萃取—超高效液相色谱—串联质谱法检测砂仁中15种有机磷类农药

张振山 李萍萍 乐渊 刘春华

摘 要 建立了分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱检测砂仁中15种有机磷类农药残留量的方法，并对16个不同产地的砂仁药材进行农药残留测定。砂仁样品经乙腈（含1%甲酸）提取和盐析剂盐析后加入N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基键合硅胶吸附剂（C18）和无水硫酸镁进行基质固相分散萃取、净化，采用超高效液相-串联质谱在多反应检测模式（MRM）下测定，外标法定量。15种农药成分在0.005～0.100 mg/L有良好的线性关系，相关系数在0.999～1.000；15种农药成分在3个添加水平下（100、200和400 μg/kg），加标回收率范围为70.0%～120.0%，RSD%（n=3）为0.5%～9.5%；各农药成分的检出限在0.1～2.0 μg/kg。该方法可应用于多产地的砂仁药材中15种有机磷类农药残留的检测。

关键词 砂仁 ；有机磷类农药 ；分散固相萃取技术 ；农药残留监测

中图分类号 O657.63 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.09.016

Abstract A determination method for 15 phosphate pesticides in Amomum villosum Lour. was established by using ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS） with offline disperse solid phase extraction. The pesticide residues in the samples of A. villosum Lour collected from 16 areas were determined. The A. villosum samples were extracted with acetonitrile （containing 0.1% formic acid）， followed by salting-out， and the extracts were further purified by N-（n-propyl）ethylenediamine （PSA）， C18 and anhydrous magnesium sulfate. The prepared samples were analyzed by the UPLC-MS under Multi Reaction Monitor （MRM）， and the external standard method was applied to quantify the pesticides. These 15 pesticides showed a good linearity in the range of 0.005 mg/L～0.100 mg/L（r=0.999-1.000）. The average recoveries of all the pesticides were in the range of 70.0%～120.0% at the three spiked levels （100 μg/kg， 200 μg/kg and 400 μg/kg）， and the RSD （n=3） was in the range of 0.5%～9.5%. The limit of detection （LOD） was 0.1 μg/kg～2.0 μg/kg. This determination method was suitable for the analysis of 15 phosphate pesticides in A. villosum Lour.

Keywords Amomum villosum Lour. ； phosphate pesticide ； disperse solid phase extraction ； pesticide residues monitoring

砂仁是一味常用的中草藥和菜肴调味品，为四大南药之一，具有化湿开胃，温脾止泻，理气安胎的功效，用于治疗湿浊中阻脘痞不饥，脾胃虚寒，呕吐泄泻，妊娠恶阻，胎动不安等症[1]。随着现代科学的发展，砂仁在治疗消化系统方面问题的功效越来越受到人们的关注，砂仁的人工种植规模在逐步扩大[2]。

有机磷农药是农业生产中应用最广泛的农药之一，具有廉价、高效、广谱以及低生物累积性的特点[3]。但有机磷农药对人体健康具有极大的危害，即使暴露于小剂量的有机磷化合物也会致命，中毒者常常由于横膈膜和肋间肌麻痹以及气道过多的分泌物引起呼吸衰竭而导致死亡，每年导致约20万人死亡，因此要严格控制有机磷的残留量[4]。目前，《中国药典》2015年版对中药材中有机磷农药的检测方法为气相色谱法，本文选取了倍硫磷等15种有机磷农药，建立了中药砂仁的超高效液相-质谱法的多残留检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

实验所用16批砂仁样品来自广东、云南、海南、广西的药材基地和药材市场（表1）。经粉碎机粉碎，过3号筛（药典筛，50目），装于密封袋中，置于干燥器中保存备用。

1.1.2 仪器

Triple Quad 4500液相色谱三重四极杆串联质谱仪，美国SCIEX公司；ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（50.0 mm×2.1 mm；1.7 μm），美国Waters公司；IKAT 18高速均质器，德国IKA公司；高速冷冻离心机，美国VISION公司；涡旋混合仪，上海青浦沪西仪器厂。

1.1.3 试剂

标准物质：倍硫磷，丙溴磷，三唑磷，伏杀硫磷，甲胺磷，二嗪磷，马拉硫磷，杀螟硫磷，灭线磷、治螟磷，地虫硫磷，苯线磷，内吸磷，久效磷，保棉磷；农药标准品均为体积分数1 000 μg/mL，购自天津农业部环境质量监督检验测试中心。液相色谱（HPLC）级乙腈、甲醇和二氯甲烷购自美国Fisher Sci-entific公司；醋酸铵、无水硫酸镁、氯化钠均为国产分析纯，购自国药集团化学试剂北京有限公司；超纯水以美国Millipore公司Milli-Q超纯水系统制备获得；0.22 μm微孔滤膜购自安谱实验科技（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標准溶液的配制

1.2.1.1 农药单标准储备溶液

各取1 mL（1000 μg/mL）农药标准溶液分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成质量浓度为100 mg/L的单标准储备液，储存于-18℃冰箱中备用。

1.2.1.2 混合标准工作溶液

各取0.10 mL上述单个农药标准储备液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成质量浓度为1.00 mg/L的混合标准工作溶液。再取1.00 mg/L的混合标准工作溶液1.00 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成质量浓度为0.10 mg/L的混合标准工作溶液。

1.2.1.3 系列浓度的标准工作液

分别移取混合标准工作溶液0.05，0.1、0.2、0.5、1.0 mL混合标准工作溶液于5.00 mL的容量瓶中，用甲醇水溶液（50%）溶解并定容至刻度，配制成质量浓度分别为0.01、0.02、0.04、0.10和0.20 μg/mL的系列浓度标准工作液。

1.2.1.4 基质标准工作溶液

精确称取5.00 g空白砂仁样品各5份，按1.2.2方法进行样品处理后，分别移取1.00 mL的上清液和系列标准浓度工作液按照体积比1∶1混合均匀，配制成浓度分别为0.005、0.01、0.02、0.05和0.10 μg/mL的基质标准工作溶液，按照1.2.3仪器工作条件，以待测物定量离子的峰面积对质量浓度作标准曲线，得到15种有机磷类农药的线性方程及相关系数。

1.2.2 样品的前处理

取16批药材粉末，精密称定5.00 g，置于100 mL离心管，加10 mL水浸泡15 min，加入4 g氯化钠和2 g无水硫酸钠，再精密加入20 mL乙腈（含1%甲酸），3 000 r/min涡旋震动60 s，再以5 000 r/min离心5 min。再取上层溶液5.0 mL于预先加200 mg PSA、200 mg C18及1 000 mg MgSO4的离心管中，涡旋60 s，再以5 000 r/min离心5 min 。取1 mL上清液与1.0 mL甲醇水溶液（50%）1∶1混合，过0.22 μm微孔滤膜，待UPLC-MS/MS分析。

1.2.3 仪器工作条件

1.2.3.1 UPLC工作条件

ACQUITY_UPLCTM BEH C18 1.7 μm 2.1×50 mm Column色谱柱，柱温35 ℃，进样量：5 μL，流动相A为1.0 mmol/L乙酸铵溶液（pH=4.5），流动相B为甲醇；梯度洗脱程序：0～2.0 min，90%～30%A；2 ～2.5 min，30% A；2.5～7.0 min，30%～5%A；7.0～9.0 min，5%A；9.0～9.1 min，5%A～90%A；9.1 ～10.0 min，90%A。流速为0.25 mL/min。

1.2.3.2 ESI-MS/MS 工作条件

正离子电离模式：毛细管电压，5 500V；离子源温度，550℃；雾化气压力，344.7 kPa；去溶剂气压力，413.7 kPa；气帘气压力，172.4 kPa；碰撞气压力，55.2 kPa。多反应监测模式（MRM）下的质谱参数见表2。

2 结果与分析

2.1 谱图分析

在电喷雾离子源电离模式下，分别对15种有机磷类农药的单标溶液进行母离子全扫描，再对各自的子离子进行全扫描，每个化合物选择2对响应值较高的特征离子作为定量离子和定性离子，并优化得到相应的去簇电压、碰撞能量等参数，结果见表2。

取混合标准溶液经超高效液相-串联质谱，获得15种农药成分的总离子流图（图1）和MRM色谱图（图2），各农药对应的保留时间见表2。

2.2 方法学验证和样品测定

2.2.1 线性范围的考察

取1.2.1中的系列浓度的标准工作液进行液质分析，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，在5.0～100.0 μg/L，标准曲线线性关系良好，相关系数R2均≥0.999，结果见表3。

2.2.2 定量限

取编号1的药材（经检测不含15种有机磷农药），加入标准溶液进行样品添加实验，按照1.2.2提取方法进行前处理试验并上机，以3倍信噪比（S/N）计算砂仁中15种农药的检测限，各农药的方法检测限在0.36 ～1.32 μg/kg 。根据10倍信噪比计算理论定量限在1.2 ～4.4 μg/kg。为配合实际样品和定量准确， 本试验从添加水平 0.2 μg/kg 一直添加到5.0 μg/kg ，通过添加回收率试验的要求，发现添加浓度到 4.0 μg/kg 时，回收率均符合定量限的要求（表4）。因此，砂仁中15 种有机磷农药的定量限通过实际添加回收试验最终确定为 0.004 mg/kg。

2.2.3 加样回收率实验

结合定量限和倍硫磷等农药的MRL值，选取0.004 0、0.006 4和0.050 mg/kg作为加样回收试验的3个添加浓度，取编号1的药材，按照1.2.2提取方法，计算15种农药回收率，每个水平平行测定3次 ，平均回收率和相对标准偏差RSD见表5。结果表明， 15 种农药残留的平均回收率范围为 73.7%～118.1%；相对标准偏差范围为 0.6%～9.6%，均满足定量分析要求。

2.2.4 样品测定

对市售的16批砂仁 ，按照上述的样品前处理方法和仪器分析条件下进行检测 ，每份样品平行测定2次，并未在样品中检测出15种有机磷类农药的存在。

3 结论与讨论

3.1 前处理条件的选择

中草药成分复杂，干扰物多。砂仁是姜科植物果实，除富含乙酰龙脑酯、樟脑等挥发性成分外，也含有色素、脂肪酸、多糖、鞣质等成分[5]，在对样品检测前，需要对样品进行一定的净化处理，以防对于待测组分的干扰。目前，GPC、固相萃取（SPE）及各种吸附剂的基质固相分散技术被广泛用于复杂基质样品的净化[6]。QuEChERS是近年来国内外在食品检测中应用十分普遍的一项前处理技术，具有操作简单、速度快、回收率高、可分析的农药范围广等优点，但净化能力较差[7]。因此，许多研究者在其基础上寻找更多的吸附净化剂不断地改进方法，如加入十八烷基键合硅胶吸附剂（C18）、石墨化碳黑（GCB）、氨丙基粉等[8-9]。本试验采用含1%甲酸的乙腈提取砂仁样品，再以PSA+C18作为吸附剂来净化砂仁提取液，PSA可以有效地吸附砂仁药材中的有机酸、鞣质等极性成分，C18则可去除砂仁中的一些非极性成分，15种农药在5.0～100.0 μg/L范围内线性良好，R2均≥0.999，在0.004 0、0.0064和0.050 mg/kg 3個添加水平进行回收试验，15种农药回收率在在70%～120%。

3.2 色谱条件的选择

目前，检测和分析食品中的有机磷农药残留的方法一般都采用气相色谱法。中国药典2015版收载方法也为采用气相-氮磷检测器或火焰光度计进行检测，但检测甲胺磷、水胺硫磷等对热不稳定的农药时，气相色谱法的抗干扰能力较弱，样品前处理方法也较复杂[10-11]。砂仁为芳香性较强的中药，采用气相色谱测定时，受到的干扰成分较多，常引起衬管和色谱柱的污染，影响仪器的灵敏度。本文采用超高效液相色谱-串联质谱法检测砂仁，方法简便快捷，灵敏度高，基质效应小，准确度高，适用于砂仁中有机磷类农药的检测。

3.3 样品测定

砂仁目前主要产于广东、广西、云南、海南四省，以云南、广东产量最高，云南栽培面积最广[12]。随着人民健康意识的提高，砂仁的经济价值在逐步提高，也刺激着药农的种植热情。砂仁目前常见的病虫害有炭疽病、苗疫病、立枯病，叶斑病，钻心虫，白粉病、蝼蛄、金龟子等，由于目前国内中药的田间管理技术还比较薄弱，偶有民间喷施甲胺磷、五氯硝基苯等农药的现象。本文采集的16批药材中，经检测，并未有倍硫磷等15种有机磷类农药的检出，推测原因为收集的样品多来源于当地的药材种植基地，收集的散户药材较少。但建立砂仁中有机磷农药的液质检测方法，对于砂仁中有机磷农药的防控监测提供了一项重要技术手段，同时，也可以为姜科同属的其他作物和药材的检测提供技术依据，具有一定的参考意义。

参考文献

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典（一部）[M]. 北京：中国医药科技出版社，2015：169.

[2] 陆山红，赵荣华，幺 晨，等. 砂仁的化学及药理研究进展[J]. 中药药理与临床，2016，32（1）：227-230.

[3] 王志超，康志娇，史雪莹，等. 有机磷类杀虫剂代谢机制研究进展[J]. 农药学学报，2015，17（1）：1-14.

[4] 赵 敏，陈良宏，张志刚，等. 有机磷农药中毒机制和治疗新进展[J]. 中国实用内科杂志，2014，34（11）：1 064-1 068.

[5] 孔令军，张娅婷，谷令彪，等. 中药材农药残留的研究进展[J]. 中国实验方剂学，2015，21（21）：231-234.

[6] 高 阳，徐应明，孙 扬，等. QuEChERS提取法在农产品农药残留检测中的应用进展[J]. 农业资源与环境学报，2014，31（2）：110-117.

[7] 乐 渊，张 群，刘春华，等. QuEChERS净化超高效液相色谱-串联质谱法检测莲雾中4种杀菌剂[J]. 分析科学学报，2016，32（3）：409-413.

[8] 宋淑玲，李重九，马晓东，等. 蔬菜中残留农药的石墨化炭黑净化和气相色谱-质谱检测方法[J]. 分析化学，2008（11）：23.

[9] 梁达清，苏肯明，张菊梅，等. 高效液相色谱-串联质谱法测定香菇中23种有机磷农药[J]. 食品科学，2014，35（4）：159-162.

[10] 刘庆斌，张 睿，王海涛，等. 高效液相色谱串联质谱法对栀子中11种有机磷农药残留的检测[J]. 分析测试学报，2010，29（1）：73-76.

[11] 张丽霞，彭建明，马 洁，等.砂仁种质资源研究概况[J]. 时珍国医国药，2009，20（4）：788-789.