江苏汉族人群30个插入/缺失位点的遗传多态性

（南京医科大学第一附属医院 江苏省人民医院司法鉴定所，江苏 南京 210029）

插入/缺失（insertion/deletion，InDel）位点兼具法医学常见遗传标记STR基因座和SNP位点的优点，在法医学研究中引起了学者的关注。在医学领域，一些InDel位点和肿瘤、遗传性疾病也具有相关性。该类遗传标记特性类似SNP位点，为二等位遗传标记，突变率低，约为10-8，是理想的补充遗传标记[1-3]。本研究主要针对江苏地区汉族人群展开，在既往用STR基因座[4-5]进行遗传学分析的基础上，运用InDel遗传标记物对该地区人群进行法医遗传学研究，以期获得相关数据，为鉴定实践及后续科研工作积累可靠依据。

1 材料与方法

1.1 样本

本研究共涉及305名汉族健康志愿者的血样，均采集于江苏地区，其中男性199名，女性106名。实验前对每名志愿者进行风险告知，并签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器

Investigator®DIPplex试剂盒（德国QIAGEN公司），甲酰胺（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

SimpliAmpTM热循环仪、3130基因分析仪（美国AB公司）。

1.3 PCR扩增和测序分型

采用Chelex-100法进行血样DNA的提取[6]。采用12.5 μL体系对试剂盒中包含的30个InDel位点进行PCR扩增，反应体系包括：2.5 μL反应缓冲液，2.5 μL引物混合物和0.3 μL DNA聚合酶，其余体积由模板DNA（0.5～2ng）及去离子水补齐。反应缓冲液中主要成分为dNTP、MgCl2和牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）。PCR 条件为：预变性 94℃ 4min；94℃ 30 s，61℃ 120 s，72℃ 75 s，30 个循环；68℃延伸60min；10℃保温。PCR产物变性后在3130基因分析仪上进行毛细管电泳，用GeneMapper®ID v3.2.1软件对InDel位点进行分型。

1.4 统计学处理

采用SNPAnalyzer v2软件对试剂盒中涉及的30个InDel位点进行Hardy-Weinberg平衡检验、频率数据统计、连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD）、三联体非父排除率（PEtrio）和二联体非父排除率（PEduo）分析。采用PowerStats v12软件统计分析30个InDel位点的多态信息含量（PIC）、个体识别率（DP）和杂合度（H）。收集国内公开发表数据[7-12]进行整理、分析，采用 Genepop v4.2（http://www.genepop.curtin.edu.au）提供的方法计算获得人群间的遗传分化系数（genetic differentiation coefficient F-statistics，Fst）及遗传距离。

2 结 果

2.1 等位基因分型结果

在305份江苏地区汉族无关个体血样中，Investigator®DIPplex试剂盒中的30个InDel位点均可以得到有效扩增，扩增片段长度为75～160bp，峰高稳定在 1000～5000RFU。

2.2 等位基因频率和相关遗传学参数

30个InDel位点均符合Hardy-Weinberg平衡定律（P＞0.05），相关的遗传学信息见表 1。

2.3 连锁不平衡分析结果

经SNPAnalyzer v2软件分析后发现，该试剂盒含有的30个InDel位点之间相互独立。采用乘积定律计算，累积个体识别率为1-7.369×10-8，二联体累积非父排除率为0.998933978，三联体累积非父排除率为0.997806392。

2.4 与其他地域汉族群体之间遗传距离分析

通过缺失频率进行7个汉族人群之间的Fst值比较和遗传距离计算结果见表2～3。

表1 30个InDel位点在江苏汉族人群中的遗传学信息 （n=305）

表1 （续）

表2 7个汉族人群的缺失频率相比获得的Fst值

表3 7个汉族人群之间的遗传距离

3 讨 论

Investigator®DIPplex试剂盒是目前市场上推出的第一个成熟化的InDel位点检测试剂盒，共包含30个常染色体InDel位点[1-3]。这一类遗传标记为长度多态性遗传标记，可以在法医学常用检测平台——遗传分析仪（310、3130、3130xl、3500 及 3500xl型）上完成检测，易于在各个法医物证实验室推广，无需增购设备。针对这一商业化检测试剂盒，目前已有华东汉族与畲族[7]、广东汉族[8]、河南汉族[9]、北京汉族[10]、广西汉族与苗族[11]、中国汉族[12]等人群数据。但介于人群之间可能存在的遗传距离差异以及总结江苏地区InDel位点遗传信息的必要性，本研究针对305名江苏地区长期居住的汉族无关个体进行了较细致的统计分析。

本研究的30个InDel位点分布在19个常染色体上，结果显示等位基因频率为0.049～0.951，各位点PIC 为 0.089～0.375，DP 为 0.093～0.500，H 为0.094～0.502，30个InDel位点的累积个体识别率为1-7.369×10-8，二联体累积非父排除率为0.998933978，三联体累积非父排除率为0.997806392。HLD118（rs16438）的最小等位基因频率（minor allele frequency，MAF）小于 0.1，5 个 InDel位点 （HLD111、HLD99、HLD64、HLD81、HLD39）的 MAF 在 0.1～0.2，3 个 InDel位点（HLD114、HLD122、HLD84）的 MAF 在 0.2～0.3，其余21个InDel位点的MAF均大于0.3。

30个InDel位点在本研究人群中均符合Hardy-Weinberg平衡定律（P＞0.05），说明江苏汉族群体在符合随机采样的情况下，群体中各个体的基因比例（频率）可从一代传到另一代且维持不变，保持遗传的平衡稳定性，本次样本随机性和采集数目符合统计学要求。30个InDel位点经连锁不平衡分析，各位点之间相互独立，如HLD83、HLD84两个位点均处于8号染色体，HLD40、HLD128和 HLD39 3个位点均处于1号染色体，亦不存在连锁不平衡现象。

通常来讲，MAF的理想状态应位于0.3～0.7，但本研究中HLD118（rs16438）位点MAF值最小，为0.049，小于广东（0.080）[8]、北京（0.0857）[10]、广西（0.100）[11]汉族人群，更接近于胡真等[7]总结的结果（0.0628），但都普遍较低，说明该基因座在已有统计的中国汉族人群中多态性分布较差，不适合中国人群。而MAF在0.1～0.3的8个位点与已报道[7-12]的人群保持相同范围。可能是因为该试剂盒位点主要基于德国人群，并非面向中国人群，造成遗传学参数均衡性及多态性相对较差。

Fst是指特定基因座在群体间的分布差异程度。Fst值越小，说明变异程度越小。有学者[13]认为，通过群体计算得到的Fst值小于0.06可保证所选择的位点适用于不同的群体，从而得到稳定的个体识别效力。本研究 Fst值小于 0.06的有 HLD77、HLD45、HLD131等25个位点，绝大部分在所关注的国内7个汉族人群中不存在分化情况。另外，Fst值大于0.06的有HLD111、HLD118、HLD64、HLD81、HLD39 共 5 个位点，说明上述5个位点在不同群体中的基因频率差异性较大。

对不同地域群体间的Fst遗传距离进行两两比较，发现：江苏汉族和广西汉族的距离最远（0.0871），与华东汉族的距离最近（0.0247）；河南汉族和北京汉族（0.038 5）、中国汉族（0.030 6）距离最近；广西汉族和除广东汉族外的其他地域汉族人群距离都相对较远（＞0.0733）。说明遗传距离和地域实际的物理距离区分度相似，人群在长年的迁徙过程中正逐步发生变化。同时，InDel作为遗传标记物，以等位基因频率计算遗传距离可用于群体遗传学的研究。

但考虑到30个InDel位点的累积个体识别率、二联体累积非父排除率、三联体累积非父排除率均低于13 个CODIS STR 分型试剂的效能（0.999 999 992）[8]，Investigator®DIPplex试剂盒所包含的30个InDel位点可以作为必要的补充遗传标记，在高度腐败、小分子量片段及肿瘤组织等疑难检材的鉴定分析中发挥作用，为相关法医物证案件及疾病遗传基因突变靶点确认提供遗传学数据支持。

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