虫体复壮蛹虫草菌种的研究*

温志新，孟楠，李学军，都兴范，马淑慧，米锐，孙永欣，李树英，李亚洁

（辽宁省农业科学院大连生物技术研究所，辽宁大连116024）

蛹虫草（Cordyceps militaris），又名北冬虫夏草，北虫草，是1种虫菌结合的药用兼食用真菌，与冬虫夏草（Cordyceps sinensis）同属异种，具有极高的营养价值和药用价值，随着冬虫夏草数量日趋减少，蛹虫草越来越受到人们的认可[1-2]，近年来，蛹虫草人工栽培已经实现工业化，但由于生产中菌种不稳定，长期冷藏菌种衰老、退化，从而影响蛹虫草规模化生产[3]。目前，针对蛹虫草菌种退化问题，通常采用组织分离法、孢子分离法和虫体回接法对菌种进行复壮[4-8]，其中虫体回接法被认为是1种有效的菌种复壮方式，许多研究表明，虫体回接可以使虫生真菌对昆虫的毒力得到回复，原有的生物学性状也得以稳定[9]。本文以活体柞蚕蛹培育蛹虫草，选择不同生长发育时期的样品进行组织分离，研究虫体复壮对母种质量的影响，为规模化生产提供性状稳定的菌种资源。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试菌株：北虫草冰峪2号，由本实验室提供。主要试剂：葡萄糖、蛋白胨、琼脂粉、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B等（均为分析纯）。

培养原料：柞蚕蛹购于辽宁省蚕业科学研究所，小麦（市售）。

1.2 方法

1.2.1 培养基制备

母种培养基：马铃薯20%、蔗糖2%、牛肉膏1%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.05%、琼脂2%。采用180 mm×18 mm的试管分装培养基，每支试管10 mL，加盖棉塞，高压灭菌锅内121℃灭菌30 min，完成后取出摆斜面，冷却，无菌检验后待用。培养基高压灭菌后冷却到45℃，倾入直径6.5 cm无菌平皿中，冷却，无菌检验后待用。

液体培养基：马铃薯20%、蔗糖2%、磷酸二氢钾0.3%、硫酸镁0.15%、蛋白胨1%，分装500 mL三角瓶中（150 mL），加盖棉塞，高压灭菌锅内121℃灭菌30 min，冷却，无菌检验后待用。

小麦培养基：小麦粒25 g，料液比1∶1.5，装于500 mL罐头瓶。营养液配方：葡萄糖2%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.05%，用自来水配制。高压灭菌锅内121℃灭菌1 h，冷却待用。

柞蚕蛹准备：选取健康柞蚕滞育蛹，用75%乙醇迅速擦洗蚕蛹体表。尤其是节间膜处（或将蚕蛹用75%乙醇浸泡2 min），再用无菌水洗去残留酒精，放在无菌托盘中晾干备用。

1.2.2 液体菌种制作

将试管母种接入上述液体培养基中，24℃恒温静止培养2 d后，再振荡培养5 d～7 d，4层纱布过滤。备用。

1.2.3 柞蚕蛹接种培养

取上述菌液注射于蚕蛹，每只蚕蛹注射量0.2 mL～0.4 mL，然后把接种后的柞蚕蛹放在消过毒的塑料盒中，送入培养室内培养至子实体成熟[10]。

1.2.4 组织分离培养

分别选取僵蛹（S1）、子实体初期（子实体＜1 cm，S2）、子实体早期（1 cm＜子实体＜3 cm，S3）、子实体中期（子实体≈5 cm，S4）、子实体成熟期（子实体＞7 cm，S5）的生长发育良好且未被污染的虫草组织。具体操作：僵蛹（S1）选取接种15 d后僵化的蚕蛹，无菌条件下切开蛹体，接种针挑取内部长满菌丝的组织块，接入平板培养基中央，适宜温度下培养；子实体生长时期按生长时间与长度选取蛹虫草形态良好并生长健壮的子实体，以子实体中上部为目标组织块，无菌水清洗3次～5次，无菌条件下切成长1 mm的小块，接入平板培养基中央，适宜温度下培养。每天观察记录组织块在培养基上的萌发和菌丝生长情况。

1.2.5 小麦培养基出草培养

待上述菌块萌发后，转入上述试管斜面培养基上，将得到的菌种分别接种于液体培养基中，约5 d～6 d后，将液体菌种接种于小麦培养基中，每个菌株各接种20个罐头瓶。相同条件下培养，待子实体成熟时采收，分别记录子实体平均长度、产量并测定生物转化率。

1.2.6 数据处理

试验数据用“平均值±标准差”表示，采用SPSS17.0软件对试验结果进行单因子显著性检验，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 不同生长时期分离母种平板培养基上菌丝生长情况

平板培养基上不同生长时期分离的蛹虫草母种菌丝生长和转色情况见表1。

表1 不同生长时期分离的蛹虫草母种菌丝生长和转色情况比较Tab.1 Comparison of hypha growth and changing color of Cordyceps militaris in different treatments

从菌丝生长势方面看，S2、S3和S4间没有差别，菌丝长势好，健壮，整齐，浓密且转色快，S1和S5菌丝长势较好，浓密但边缘不整齐，转色稍慢；从菌丝生长速度方面看，S3生长最快，日均生长速度为3.75 mm·d-1，其次是S2和S4，最慢是S5。多重比较表明，S2、S3，与S4分离的母种菌丝日均生长速度相比差异不显著，但都与S1、S5两个生长期的生长速度差异显著，由此可知，经虫体回接法获得的子实体早期（S3）分离得到母种菌丝体生长速度最快，长势最好，为母种组织分离的最佳时期，其次为子实体初期（S2）。

2.2 不同生长期分离母种继代培养对子实体产量影响

子实体采收均统一设定为接种小麦培养基后培养第40 d采收，经继代培养得到的虫草子实体指标参数见表2。

表2 分离母种继代培养子实体的生长性状调查Tab.2 Growth status of fruiting body from subculture isolated from mother spawn

由表2可知，从子实体长度方面看，S3最长，但各生长期分离的菌种继代间差异不显著；从每瓶子实体鲜重与生物转化率方面来看，S5明显低于其他各生长期，差异达到显著水平，S3表现最好，其次是S2。说明虫体复壮分离除了子实体成熟期（S5）以外，其他各生长期分离母种继代培养子实体生长性状均表现良好，而S3为最适合的时期。

3 结论与讨论

本研究利用活体柞蚕蛹复壮蛹虫草菌种，试验结果表明，选取不同生长发育时期的蛹虫草组织分离母种，无论是菌丝生长势还是继代培养子实体的生长性状，S3均表现最佳，即经虫体复壮获得的子实体早期（S3）为最适合的母种组织分离时期，其后依次是子实体初期（S2）、子实体中期（S4）和僵蛹期（S1），最差是子实体成熟期（S5），可能由于成熟期细胞老化活力下降而导致分离的母种菌丝长势及继代培养子实体生长效果差[11]，因此，不适合在这个时期进行组织分离母种。王殿振等[12]采用孢子分离、组织分离、活体蚕蛹、基内菌丝分离、蚕蛹回接等5种菌种复壮法，其中活体蚕蛹复壮法是当子实体长到2 cm～3 cm时做组织分离，而蚕蛹回接采用僵蛹组织块，试验确定活体蚕蛹复壮法是5种方法中最好的菌种复壮法，与本研究结果基本一致。蛹虫草菌种退化是普遍存在的问题，菌种退化的具体机理目前还不清楚。李美娜等[13]用PCR-RFLP和RAPD方法证实退化菌株较野生驯化菌株在DNA水平上发生了频率较高的突变，这些变异既可能发生在核基因组，也可能发生在线粒体基因组。魏静[14]以蛹虫草同核体菌株中克隆得到2种交配型基因，发现退化菌株只含有其中的1种类型交配型基因。因此，下一步要从遗传物质DNA着手，寻找更好地解决蛹虫草菌种退化问题的办法，为生产实践提供参考。

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