影响鸡新城疫抗体水平测定结果的关键操作要点

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(娄底职业技术学院，湖南 娄底 417000)

0 引言

“鸡新城疫抗体水平测定”竞赛做为农林牧渔专业大类中全国职业技能大赛的重要赛项已经开展多年。通过竞赛，一方面深化了职业教育教学改革，推进了校企深度合作、产教高度融合，培养了一大批高、精、尖技能型人才，为产业发展提供了技术支撑，另一方面能够不断发现操作中存在的不足，进一步完善操作规程，全面提高检测效能，创造更好的经济效益和社会价值，确保行业生产更加安全。本文笔者结合近年来指导学生参加鸡新城疫抗体水平测定赛项竞赛指导体会、赛项规定[1]和多年的临床检测经验，总结出来的一些操作关键技术要点，供同仁们参考。

1 室温控制是保障

实验室温度的高低直接影响试验结果。为保障试验顺利进行，技术人员或赛点单位在试验要高度重视、精心安排做好这项工作。

1.1 低温影响

低温环境下，在试验开始前要打开空调预温，待室温达到20℃时才能开展试验。试验表明：室内温度低于20℃就开展试验，或室内温度不能稳定在20℃～25℃，红细胞沉淀的时间延长，HI试验滴度与标准滴度相差1～2个，有的甚至不能判定结果。

1.2 高温影响

当室温超过25℃，湿度低于50%时，水份蒸发，反应物解离，红细胞自溶，后续试验就无从谈起。

2 移液精准是核心

2.1 校准设备

试验前，要细心检查移液设备，校准移液器，确保移液量精准。如果比赛，赛点单位要对所有移液设备认真校验，减少误差，保证选手公平参赛。

2.2 调节量程

吸液前要将量程调到目标刻度，操作中也要注意观察量程是否自动移位，防止移液量发生变化，影响试验结果。

2.3 装配吸头

将移液枪垂直对准吸头，稍微用力下压并向左向右转动180°角即可上紧，杜绝用力反复锤撞吸头。移液前先校验吸头是否装紧、吸嘴是否有堵塞和歪斜等现象。若吸头未装紧轻则吸头内出现气泡，吸液量不足，重则吸头掉落；吸孔有堵塞则吸不上液；若吸头嘴歪，放液时液体会斜向打出，等等，发现问题都要更换吸头。

2.4 正确移液

正向移液，用大拇指按到第一档，并将吸头尖端垂直浸入液面3 mm左右[2]，释放按钮，液体进入吸头；放液时，将移液器垂直对准反应板孔，快速按到二档，将液体打入孔内。操作时避免打液后吸头内外存留液体；切忌放液时将液体打在反应板孔壁周围及孔外；加液时杜绝吸嘴碰触反应板孔的液面；倍比稀释时移液器要往顺手方向倾斜5°～10°角，既要防止吸嘴垂直顶住孔底壁吹打不动，又要防止吸嘴浮出液面吸入空气吹出气泡，每孔吹打速度要均匀、不能过快，吹打次数要一致；加红细胞悬液时最好从后往前悬滴加入[3]，每加一排要摇匀杯内液体；记住每滴加一个样要及时更换吸头[4],否则均会出现试验误差。

3 悬液配制是前提

3.1 采血

采血过程两人配合要默契[5]。采血前要准备好酒精棉球、干棉球、吸入含抗凝剂的采血器(抗凝剂与血液的比例为1∶4)。抓鸡要轻、稳、准、巧。鸡抓出后，在鸡笼上侧卧保定。助手一手抓住鸡的小腿与后脚骨并固定好跗关节，防止鸡腿划动，另一手抓住鸡翅，呈扇形张开固定，鸡胸部朝向采血者。采血部位消毒，用拇指压住近心端，血管怒张后，针头先挑起血管侧边皮肤，再由翼根向翅方向平行刺入静脉，见回血，放松对近心端的按压，缓慢抽取血液。采血完毕一手用干棉球按压止血，另一手盖上采血器针帽，将采血器稍向后抽，轻轻摇匀血液，防止血液凝固。

3.2 配平

拧掉采血器上的针头，将采血器中混匀后的血液(2.5 mL)沿离心管壁轻轻注入已加有少量生理盐水并标记“鸡血”的离心管中，防止红细胞破坏，再缓慢加入生理盐水至10 mL吹打混匀，与标记“盐水”的离心管用天平配平。配平时应先使天平上的烧杯平衡，再将离心套管和离心管放入烧杯中配平。如果不平衡，一般用移液器向标注的“盐水”离心管内添加或吸出生理盐水，直至配平。配平后盖上离心管盖准备离心。

3.3 离心

接通电源，将已配平的“鸡血”和“盐水”两个离心管及套管放入离心机中，盖上离心机盖，调好时间和转速，前两次分别离心5 min,第三次离心8 min，转速2 000 r/min。注意每次离心前都要配平，离心管中的液量不要超过最大量程刻度。离心时必须看守，如有异常，应马上停用。使用完毕，各项数据归零，关掉电源。

3.4 洗涤

先要吸取白细胞和血小板层，此时要注意动作轻、速度慢、吸量微，避免吸走红细胞，然后吸取剩余的透明液体。在沉淀的红细胞中再加入稀释液(生理盐水)，吹打混匀、洗涤、离心，以此类推，一般洗涤3次即可。

3.5 悬液配制

最后一次离心完毕，按所需1%红细胞的量，用移液器垂直从离心管中、下部吸取压积红细胞放入已加好需量生理盐水的烧杯中，摇匀备用。

3.6 问题处理

鸡只采血部位要严格消毒，避免污物进入血液。如采血不畅，采血器内会产生血凝块，所采血液失去试验价值，必须弃之重来。若使用柠檬酸钠抗凝剂，其配制浓度必须精准，如果浓度过低，离心后会产生胶冻样物质。个别鸡只的红细胞有自凝现象，因此应准备3只以上的鸡[6]。离心结束，红细胞沉于离心管底，上液清亮透明，可认定红细胞配制成功；若上液显红色，说明悬液制作失败。制作悬液时因表面部分红细胞浓度相对较低，配制的悬液浓度不够，所以应抽取管内中、下处的红细胞。

4 4HAU病毒浓度是基础

根据血凝试验结果配制4HAU病毒。首先根据需要准确计算出生理盐水和抗原的量，然后用适量移液器在小烧杯中加入生理盐水，再加入抗原，并反复吹洗混匀。因4HAU病毒浓度直接影响试验结果，最好做一个回滴实验[7]，校正4HAU病毒的配制浓度。

5 适宜感作是重点

感作需要时间。在这个过程中，有的性急，为了使红细胞尽快沉下孔底，或使4HAU抗原尽快混匀，在板上使劲地敲，这是不合规的，容易震碎红细胞，震出液体等；有的不根据实际反应结果而机械地按照规定的时间去等，这样浪费时间。因此，在感作过程中应做好以下工作：加4HAU抗原后，为了混匀，可以轻叩反应板或使用微型震荡器震荡30～60 s，使其充分混均匀。感作时间规定不少于30 min，不能任意缩短时间。1%鸡红细胞悬液加完后，可以轻晃或用微型震荡器震荡20-30 s，使其混合均匀，感作时间是一个变数，要与对照孔的实际结果有机结合。

6 结果判定是关键

结果判定，首先牢记一个“明显”，即两个试验均以生理盐水对照孔红细胞呈现“明显”钮扣状沉到孔底时才能判定结果，否则需要继续等待。然后把控两个“完全”，两个“完全”的区别在于血凝试验时，倾斜反应板后红细胞“完全”不流动，说明红细胞被病毒凝集，以完全凝集的病毒最大稀释度确定为该抗原的血凝滴度；血凝抑制试验，将反应板倾斜，从背侧观察，红细胞呈泪珠状“完全”流下，产生完全不凝集的最高稀释度就是滴度。

[1] 2017年全国职业院校技能大赛福建赛区组委会.2017年全国职业院校技能大赛赛项指南[Z].2017.

[2] 王丽娟,卜春华.参加全国鸡新城疫抗体水平测定竞赛的体会[J].养殖与饲料,2015(6):27-28.

[3] 陈文东,苏满春,朱秀娟,等.指导高职生参加鸡新城疫抗体水平测定技能大赛的体会[J].甘肃科技,2017,33(3):33-34+49.

[4] 王丽娟.鸡新城疫抗体水平测定技能大赛体会总结[J].黑龙江畜牧兽医,2015(16):200-202.

[5] 杨永倩,张勃伟,成梦玲.鸡新城疫抗体水平测定技能大赛培训总结[J].安徽农业科学,2016,44(20):240-241.

[6] 姜汹.影响鸡新城疫抗体水平测定结果的因素[J].当代畜牧,2017(15):47.

[7] 陆品红,王丽娟.4HUA抗原回滴操作在禽流感试验中的重要性[J].中国畜禽种业, 2009, 5(8): 134.