微小RNA在恶性肿瘤诊断与治疗中的研究进展

罗和生，万一圆，黄晓东

(1.武汉大学人民医院消化内科，湖北 武汉 430060；2.武汉大学附属同仁医院消化内科，湖北 武汉 430060)

微小RNA(microRNA，miRNA)是迄今研究最为普遍的一类内源性单链非编码小分子RNA，最初于1993年发现于线虫体内，目前为止已有超过1万个miRNA相继在人类、小鼠、果蝇、线虫和植物等物种中被发现，其中在人类中已被发现的miRNA有上千种[1]。miRNA广泛存在于真核细胞生物体内，长 21～25个核苷酸，由长60～110个核苷酸带茎环结构的双链RNA前体剪切而成，具有高度保守性、时序性和组织特异性。在哺乳动物体内，成熟miRNA的形成可分为细胞核和细胞质2个阶段。首先，miRNA基因转录合成初始miRNA，经Drosha酶切后形成前体miRNA，前体miRNA进入细胞质，在Dicer酶作用下形成双链miRNA，其中互补链降解后，成熟的miRNA与RNA诱导沉默复合物形成复合体。miRNA通过与靶mRNA分子的3′非编码区完全或不完全互补序列结合，靶向降解mRNA或抑制mRNA翻译，在转录后水平达到基因沉默效果。miRNA参与生命过程的诸多重要进程，能调节人类30%的基因，其生物学功能包括参与胚胎发育、细胞增殖、凋亡和分化等，其异常表达可能导致人类各种疾病的发生及发展，包括肿瘤性疾病、心血管疾病、内分泌疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病、神经变性疾病等；其中，关于miRNA介导恶性肿瘤性疾病的发生、发展机制一直是研究的焦点及热点。继miRNA-15和miRNA-16首次被CALIN等[2]证实为在慢性淋巴细胞性白血病中具有抑癌基因作用以来，陆续发现了大量与恶性肿瘤密切相关的miRNA，涉及人体多个系统器官，其生物学功能主要包括参与恶性肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭、转移以及耐药等多个方面。随着对其作用机制的深入研究，miRNA与肿瘤的关系受到了越来越多的重视，miRNA通过参与细胞增殖、凋亡、侵袭及转移等生物学行为，进而介导肿瘤的发生、发展机制，根据其所调控基因的不同，miRNA在不同肿瘤中可能作为癌基因发挥促癌作用，也可能作为抑癌基因抑制肿瘤的发生、发展。本文就miRNA参与肿瘤发病的机制以及 miRNA 在肿瘤诊断、治疗和预后等方面的相关研究加以综述，以期为临床早期诊断及治疗恶性肿瘤提供新的思路。

1 miRNA参与肿瘤发病的机制

1.1致癌性miRNA根据其作用的靶基因不同，miRNA在不同组织、不同肿瘤中发挥促癌或抑癌作用。miRNA在肿瘤中表达上调表明其可能发挥癌基因作用，其中研究最多的就是miRNA-21。VOLINIA等[3]对来源于6种实体瘤的miRNA表达谱进行分析，包括肺癌、乳腺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌和前列腺癌，结果表明miRNA-21的表达均显著上调。随着研究的深入，发现miRNA-21 在肝细胞癌、食管癌、肾癌和宫颈癌等组织样本和细胞株中也呈现过表达状态[4-7]，提示miRNA-21在肿瘤形成过程中起到广泛的致癌作用。目前研究发现，miRNA-21主要通过作用于下游人第10号染色体缺失磷酸酶、原肌球蛋白1、程序性细胞死亡4等与增殖、侵袭、转移相关基因进而发挥原癌基因作用[4，8]。另有研究发现，miRNA-25在多种肿瘤中都具有癌基因作用，在非小细胞肺癌中，miRNA-25能够通过下调促凋亡基因MOAP1，促进肺癌细胞的生长增殖[9]。ZHANG等[10]发现，miRNA-25在神经胶质瘤组织中表达上调，通过抑制周期蛋白依赖激酶抑制因子1C(Cyclin-dependent kinase inhibitor 1C，CDKN1C)的表达，达到促进肿瘤生长的目的；而解除内源性miRNA-25的作用后，CDKN1C的表达上调，进而参与正常的细胞周期进程。

1.2抑癌性miRNA生物体内某些miRNA在肿瘤中表达下调，是通过负性调控癌基因而达到抑癌基因作用。研究发现，miRNA-144 参与了多种肿瘤的发病，胃癌患者癌组织及血浆中miRNA-144表达显著减少，且减少程度与患者临床分期及淋巴结转移呈正相关，同时miRNA-144表达越少，患者5 a生存率也越差[11]。在胰腺癌患者癌组织及PCNA-1细胞系中，miRNA-144-3p的表达显著下调，miRNA-144-3p通过将细胞阻滞在细胞周期S期干扰细胞内DNA复制，从而抑制PCNA-1细胞增殖[12]。此研究通过双荧光素酶报告基因实验证实miRNA-144-3p的靶蛋白为脯氨酸富集蛋白11(proline-rich protein 11，PRR11)，通过抑制PRR11基因mRNA的翻译从而发挥抑癌作用。此研究还证实，miRNA-144-3p可以影响促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路参与胰腺癌的发生、发展。miRNA-144在宫颈癌患者癌组织中显著下调，且在伴有淋巴结转移患者中表达更低，其机制可能是miRNA-144通过作用于血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)和VEGFC抑制宫颈癌细胞的增殖及转移[13]。侵袭及转移能力是恶性肿瘤区别于良性肿瘤的重要特性，也是患者主要死亡原因。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮到间质细胞的转化，这一改变赋予细胞转移及侵袭的能力，细胞获得干细胞特性，细胞抗凋亡能力增强，参与一系列病理过程，如慢性炎症、组织愈合、器官纤维化甚至肿瘤的发生。随着研究进一步深入，发现在肿瘤的恶性演变过程中存在EMT现象[14]。通过EMT，上皮细胞失去了细胞极性，失去与基底膜的连接等上皮表型，获得了较高的迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力等间质表型。EMT是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程。研究表明，miRNA-542-3p在肝癌组织及细胞系中表达下调，miRNA-542-3p通过调节下游转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)基因的表达，影响TGF-β相关信号通路，进而促进肝癌细胞EMT的发生导致预后不良[15]。研究表明，Twist基因在EMT调控中起着关键作用，Twist过表达与肿瘤的分化、肿瘤大小、侵袭转移密切相关[16]。在卵巢癌患者组织中，miRNA-320的表达下调，而Twist1的表达上调，经研究证实Twist1作为miRNA-320的下游靶基因，能够促进卵巢癌细胞侵袭能力[17]。在神经胶质瘤细胞中，过表达miRNA-361-5p抑制细胞侵袭转移能力及EMT现象，然而，恢复Twist1的表达能够显著逆转miRNA-361-5p的上述作用，表明miRNA-361-5p可能通过作用于Twist1参与神经胶质瘤EMT的发生[18]。

2 miRNA与肿瘤的诊断和预后评估

随着基因芯片技术的发展，差异表达miRNA广泛应用于肿瘤研究中。利用miRNA差异表达谱可将癌组织与正常组织区分开来。miRNA存在于人类及多种哺乳动物的血清、血浆、尿液及其他体液[19-21]中，并且血清中的miRNA非常稳定，不易被内源性RNA酶降解。肿瘤组织中miRNA水平的改变，也可类似地反映在肿瘤患者血清和血浆中。因此，检测血清或血浆的miRNA水平，可作为一种非侵入性诊断指标，对肿瘤的诊断提供一定帮助。同时，人体内miRNA水平的高低还可以提示恶性肿瘤的分期以及预后情况，对判断恶性肿瘤进展以及评估临床肿瘤患者5 a生存率具有十分重要的意义。

2.1miRNA与肿瘤的诊断FRAMPON等[22]利用miRNA芯片分析，在胰腺癌患者血液中发现了7个表达上调(miRNA-21、-23a、-31、-100、-143、-155和 miRNA-221)和3个表达下调(miRNA-148a、-217和miRNA-375)的miRNA。在一项病例对照研究中，WEN等[23]发现，在HBV阳性肝癌患者血浆中miRNA-20a-5p、-25-3p、30a-5p、-92a-3p、-132-3p、-185-5p、-320a和miRNA-324-3p这8种miRNA的表达显著升高，其敏感度和特异度分别为86.6%和64.6%，以上8种miRNA表达谱可用来区分肝癌患者和正常对照。其中meta分析结果提示，miRNA-20a-5p、-320a、-324-3p和miRNA-375这4种miRNA可能作为检测肝癌患者的早期指标。有研究发现，胰腺癌患者血清或血浆中存在差异表达的miRNA，在这项研究中，WEI等[24]利用随机效应模型评估这些miRNA诊断胰腺癌病例的敏感性、特异性，结果发现，在单个miRNA调节异常中，有32个miRNA表达上调，有5个miRNA表达下调。同时，利用miRNA表达谱结合糖抗原19-9共同诊断胰腺癌患者，发现其敏感性高达0.77～0.85，特异性也在0.70～0.87之间。LU等[25]研究确定了血浆 miRNA 中两种诊断组合：panel Ⅰ (miRNA-17、-190b、-19a、-19b、-26b和miRNA-375)诊断的敏感度为86.8%，曲线下面积(area under the curve,AUC)为0.873；panel Ⅱ(miRNA-17、miRNA-190b、miRNA-375)诊断的敏感度为86.9%，AUC为0.878。这些结果表明，检测差异表达miRNA可能作为诊断恶性肿瘤的一种手段。因此，通过检测血清或血浆中的 miRNA表达情况可以作为一种临床上重要的无创性检测癌症的手段。

2.2miRNA与肿瘤的预后评估利用miRNA表达谱的数据不仅能将肿瘤组织和正常组织区分开来，还能够区分肿瘤恶性程度和判断肿瘤TNM分期，评估肿瘤的预后。一项关于结直肠癌的研究发现，miRNA-24-2的水平可以作为区分结直肠癌患者恶性程度的标志，与正常人相比，结直肠癌患者血清miRNA-24-2的表达显著升高，而且恶性程度越高的结直肠癌患者，血清miRNA-24-2的水平越低[26]。LI等[27]研究发现，胰腺癌组织中低表达的miRNA-218与TNM分期、远处转移和肿瘤分化程度密切相关，低表达miRNA-218显著缩短胰腺癌患者总生存时间。所以，低表达miRNA-218有助于判断胰腺癌的分期和评估其预后。另一项研究发现，miRNA-145作为诊断非小细胞肺癌的候选指标，无论其临床分期程度，miRNA-145的表达水平都是显著减少的，然而在Ⅰ～Ⅱ期行手术切除肿瘤组织的患者中，miRNA-145的表达水平升高[28]。这些结果表明，miRNA-145可能作为诊断Ⅰ～Ⅳ期非小细胞肺癌的相关指标。同时该研究还发现，miRNA-20a 和miRNA-21 的表达水平在不同分期的肿瘤患者中存在显著差异[28]。MARCHESI等[29]发现，诊断为弥漫性大B细胞淋巴瘤的患者血清中miRNA-22的表达上调，提示无进展期生存期短。有文献表明，miRNA-21的表达水平与非小细胞肺癌患者总生存期及肺腺癌患者无复发生存时间呈负相关[30]。乳腺癌患者中miRNA-210的表达水平与肿瘤的复发呈正相关[31]。此外，miRNA还可以作为监测肿瘤治疗效果的指标，有研究表明，检测血清miRNA可以用于监测进展期非小细胞肺癌患者对高剂量放射治疗的反应[32]。所以，研究这些miRNA有利于患者的预后评估，并可能为改善预后提供新思路。

3 miRNA与肿瘤的治疗

miRNA是一类在肿瘤领域中研究较为广泛的生物分子，其发现是生物学发展进程中一大突破。miRNA参与细胞增殖、细胞周期调节、血管形成、肿瘤侵袭和转移等多个肿瘤恶性表型进程。同时，miRNA作为肿瘤信号通路上异常表达的调控因子，是潜在的治疗靶点。

miRNA应用于肿瘤治疗作用强大，随着技术的不断成熟，利用反义核酸或者小干扰RNA技术有效沉默某个原癌 miRNA 的表达或增强某个抑癌miRNA的表达水平，用于肿瘤的生物学治疗，具有重要意义和价值。miRNA模拟物是经过特殊标志和化学修饰的双链小RNA，通过模拟内源性的miRNA来调节靶基因的生物学功能。miRNA拮抗剂是根据miRNA成熟体序列设计、经过特殊标志与化学修饰的单链小RNA，是专门用于抑制内源性miRNA的高效阻断剂[33-35]。临床前研究已经表明，通过使用合成或化学修饰的反义寡核苷酸来靶向成熟的miRNA或其前体，能减轻肿瘤负担[36]。目前，体内注射相应的miRNA模拟物或拮抗剂从而达到抑制肿瘤生长的目的，其用途主要集中在动物实验的应用中。

miRNA在恶性肿瘤治疗中的应用主要体现在两个方面，一方面是miRNA可以作为肿瘤治疗的新靶点，另一方面是可以影响其他抗癌药物的作用。在肝癌细胞系HCCLM3中过表达miRNA-501-3p会抑制细胞增殖，改变肿瘤细胞上皮间质样变，抑制肿瘤细胞的迁徙和转移[37]。在肾癌细胞中过表达miRNA-205会抑制细胞增殖，抑制细胞集落的形成，同时会导致G0/G1细胞周期停滞从而诱导细胞凋亡，减少细胞周期蛋白D1和c-Myc表达，抑制肾癌细胞迁移和侵袭[38]。BAO等[39]研究发现，miRNA-101可以通过抑制胃癌细胞增殖及促进其凋亡，从而加强胃癌细胞对顺铂类或长春新碱等化学治疗药物的敏感性，进而缓解胃癌化学耐药。体外研究发现，通过促进 miRNA-455-3p的表达可以增强胰腺癌细胞对吉西他滨化疗药物的敏感性[40]。

利用miRNA差异表达谱可将癌组织与正常组织区分开来，同时通过在缺失或过表达的恶性肿瘤中过表达或干扰miRNA的作用以达到治疗效果。然而，在实际应用中会出现各种限制，例如前文提到的采用miRNA模拟物或拮抗剂干预肿瘤的治疗，目前仅限于细胞及动物实验。因此，近年来的研究逐渐扩展到其他方面，通过结合分子生物学及相关学科等技术，以期将miRNA治疗恶性肿瘤应用于临床治疗。考虑到病毒运载安全性的问题，从最初研究腺病毒和慢病毒载体，到目前越来越多的研究集中在非病毒载体miRNA的应用。例如，采用脂质纳米粒子包装成熟的miRNA能够直接呈递到肿瘤组织和全身系统，靶向miRNA的表达从而达到治疗效果。PASSDOURO等[41]运用纳米系统拮抗胰腺癌细胞中miRNA-21的表达，并联合低剂量的化疗药物舒尼替尼治疗，产生强烈的协同抗癌效应，这种联合治疗方案对胰腺癌有潜在的治疗价值。ARORA等[42]研发了一种miRNA-150纳米药物制剂(miRNA-150-NF)，因其高包覆率和缓释能力，当将其介导入胰腺癌细胞进行治疗时，会在细胞内释放出有效的miRNA-150浓度，引起下游靶基因MUC4下调，从而抑制细胞生长、集落形成及侵袭能力。由此可见，miRNA作为肿瘤治疗的新靶点，具有十分广阔的前景。

4 问题与展望

随着研究的深入，越来越多的miRNA被人类熟知，同时其下游的作用靶点或靶基因也在不断被发现，其目的在于探索miRNA参与肿瘤发生、发展的分子机制，以期将其应用于肿瘤临床的早期诊断和早期治疗，提高肿瘤患者的生存率。然而，一个miRNA可以作用于多个靶基因及多条信号通路，干扰该miRNA后，可能会对其他信号因子产生巨大影响，因此，将miRNA用于临床治疗方面仍然面临着巨大挑战。但是，miRNA为肿瘤治疗提供新的依据和切入点是毋庸置疑的。同一miRNA在不同肿瘤中可能发挥截然相反的作用，因此，肿瘤微环境可能对miRNA的表达及活性产生一定影响。同时，由于miRNA功能的特殊性，不同miRNA分子间的相互作用关系也成为探索的新领域。近年来，关于非编码RNA的研究不断拓宽，发现其他具有重要生物学功能的非编码RNA也参与人类各种疾病(包括肿瘤)的发生，其中包括长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)、环状RNA(circular RNA，circRNA)等，这又吸引了一大批研究者将目光转向研究lncRNA、circRNA以及它们与miRNA之间共同作用参与肿瘤的发生、发展机制。生命体内是一个复杂的、系统的内环境，肿瘤的发生伴随着一系列基因的改变，这些改变形成一个复杂的、庞大的网络系统，随着研究的深入，有助于更全面了解肿瘤的发生、发展机制，为今后抗肿瘤治疗，解决临床肿瘤患者痛苦提供新的依据。