G试验联合GM试验诊断恶性血液病患者侵袭性真菌病的价值

陈婷婷 刘永林 钱煦岱 李晓芳 包文婷 李强⋆

侵袭性真菌病（invasive fungal disease，IFD）系真菌侵入人体，在组织、器官或血液中生长、繁殖，并导致炎症反应及组织损伤的疾病［1］。在恶性血液病患者中，由于长期使用抗生素、激素及免疫抑制剂，自身免疫功能低下，极易得IFD。大部分恶性血液病患者不能耐受明确诊断的侵入性检查，且传统镜检及真菌培养存在检出灵敏度不高，培养周期长，延误抗真菌治疗［2］。因此，（1，3）-β-D-葡聚糖（G试验）和半乳甘露聚糖抗原（GM试验）非侵入性真菌检测得到广泛应用［3］。本文旨在探讨G试验和GM试验联合检测在恶性血液病患者IFD的临床诊断价值。

1 临床资料

1.1 一般资料 选择2016年1月至10月本院血液科存在高危侵袭性真菌感染因素的患者304例，包括：（1）近期粒细胞缺乏，并持续＞10d。（2）接受异基因造血干细胞移植。（3）使用糖皮质激素＞3周。（4）90d内曾使用免疫抑制剂。（5）有侵袭性真菌感染史。（6）存在免疫缺陷。其中男162例，女142例；年龄4～93岁。304例患者中，淋巴瘤80例，急性髓系白血病60例，再生障碍性贫血48例，骨髓增生异常综合征29例，多发性骨髓瘤26例，血小板减少症19例，急性淋巴细胞白血病16例，慢性髓系白血病13例，慢性淋巴细胞白血病9例，其他4例。

1.2 诊断标准 根据2008年欧洲癌症 和治疗组织侵袭性真菌感染协作组和美国国立变态反应和感染病研究院真菌病研究组（EORTC/MSG）对侵袭性真菌病（IFD）的修正定义［4］及国内制定的《血液病/恶性肿瘤患者侵袭性真菌病的诊断标准与治疗原则》指南［5］，本研究不将G试验和GM试验结果作为微生物学证据，依据真菌感染可能性将患者分为确诊组7例，临床诊断组32例，拟诊组42例和排除诊断组223例。根据治疗后疗效、临床症状及检查结果回顾性分析G试验及GM试验在恶性血液病中IFD的诊断价值。G试验联合GM试验（并联）：G试验或GM试验结果有一个阳性则判定为阳性；G试验联合GM试验（串联）：G试验和GM试验结果同时阳性则判定为阳性。

1.3 方法 （1）试剂与仪器： G试验检测试剂盒采用真菌（1，3）-β-D-葡聚糖检测试剂盒（动态浊度法），购自湛江安度斯生物有限公司；仪器为捷能确TAL-80E型试管恒温仪和LKM-02-32型动态试管检测仪。GM试验检测试剂盒采用曲霉菌抗原检测试剂盒（酶联免疫法），购自BIO-RAD公司，仪器为BIO-RAD iMark酶标仪。（2）样本采集：使用不含β-D-葡聚糖的血清采血管和肝素采血管采集患者空腹静脉血3ml，400g 离心10min，分离血清后置于2-8°C冰箱待测。（3）结果判定：根据G试验诊断IFD的ROC曲线，选取G试验最佳临界值。GM试验主要用于诊断曲霉菌感染，界值参照试剂说明书，根据待测血清指数I （I=样本OD值/临界值对照OD值均值）≥0.50判定GM试验阳性。阴性对照、阳性对照和临界对照在每次实验中必须检测，以验证结果的有效性。遇到多次检测结果，选取抗真菌治疗前结果，且1周内重复2次检测结果均阳性则判断为阳性。

1.4 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件。对G试验诊断IFD的ROC曲线进行分析，分析G试验及联合GM试验在IFD诊断中的灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 G试验诊断界值的确定 通过分析304例患者G试验检测结果，根据G试验在IFD诊断的ROC曲线［AUC=0.803（95%CI 0.734～0.878），P＜0.01］， 在 G 试 验界值定为150.55pg/ml时，其灵敏度和特异性之和最高，G试验界值定为≥150.55pg/ml，判定阳性。（见图 1）。

图1 G试验在IFD诊断中的ROC曲线

2.2 各组G试验与GM试验结果 见表1。

表1 各组G试验及GM试验检测结果

2.3 G试验、G试验联合GM试验（并联或串联）对IFD的诊断效能 以排除诊断组为非感染组，确诊组和临床诊断组为感染组，单独G试验诊断灵敏度、特异性、阳性预测值与阴性预测值分别为：66.67%、92.37%、60.46%和94.06%；G试验串联GM试验分别为：38.46%、98.20%、78.94%和90.12%；G试验并联GM试验分别为：82.05%、88.34%、55.17%和96.57%。见表2。

表2 G试验和GM试验在感染组中诊断效能（%）

3 讨论

G试验主要检测（1，3）-β-D-葡聚糖，其主要存在真菌细胞壁中（接合菌和隐球菌除外），在IFD中，机体吞噬细胞吞噬真菌，早期能够持续释放（1，3）-β-D-葡聚糖入血和体液，但真菌在体内含量减少时，机体能够迅速清除（1，3）-β-D-葡聚糖，导致在血或体液中无法检测，在使用纤维素膜进行血透患者，静脉注射免疫球蛋白或血制品、链球菌血症、使用多糖类化疗药物等情况，导致G试验出现假阳性［6］。

GM试验检测半乳甘露聚糖抗原，主要适用于侵袭性曲霉菌感染（invasive aspergillosis，IA）的检测，在曾使用抗真菌治疗药物或者机体感染不严重，半乳甘露聚糖抗原含量不高会导致检测结果假阴性，而在年幼的儿童、食用谷类食品或牛奶制品、使用哌拉西林/他唑巴坦等半合成青霉素等会产生假阳性结果。有文献报道，在IA诊断中，GM试验先于培养结果早平均10.5d，先于X射线阳性结果平均5d，先于临床确诊平均17d，可以为及早治疗提供依据［7-8］。

本资料确诊和临床诊断患者39例，G试验阳性26例，GM试验阳性21例，G试验并联GM试验，灵敏度从66.67%提高至82.05%；G试验串联GM试验，特异性从92.37%提高至98.20%。G试验联合GM试验可以提高在IFD中的诊断效能，指导临床及早治疗，提高生存率。G试验并联GM试验，阴性预测值达到96.57%，高特异性可以辅助排除阴性患者，避免临床过度抗真菌治疗，降低药物副作用。本资料中，G试验诊断灵敏度66.67%，接近童彤等［9］报道，但低于本院早期报道［10］，可能和G试验的诊断界值重新设置，血液病病种组成比例、疾病进程不同，疾病治疗方案的改变有关。

目前G试验检测试剂盒多样化，各医院的患者组成不同，中医院在临床用药中药占比高，较多中药存在多糖类成分，因此实验室需要根据自身检测结果和临床诊断建立自己的诊断界值。本资料设置G试验的诊断界值为150.55pg/ml，较试剂说明书100.5pg/ml高，可能和中医院大比例使用中药有关，中药制品可能含有β-葡聚糖，对G试验检测存在干扰。GM试验主要用于IA诊断，由于本次分析数据中，确诊侵袭性曲霉菌患者数量较少，故参考说明书的GM诊断界值，在后续新增病例中，可以探讨不同GM的诊断界值在IA中的诊断效能。另外，虽然G试验并联GM试验，提高IFD诊断的灵敏度，但结果并不是很优越，依然存在一部分患者漏检，错过最佳抢先治疗时机。因此，寻求一些灵敏度更高，特异性依然好的血清学指标仍然是以后努力的方向。

［1］ 廖万清,陈敏.侵袭性真菌病的诊断:现状与展望.菌物学报,2011, 30(1): 5-11.

［2］ 马永超.血液病患者真菌血症临床特征回顾性研究.中华医院感染学杂志, 2016,26(9): 1987-1989.

［3］ Maertens J. Screening for circulating galactomannan as a noninvasive diagnostic tool for invasive aspergillosis in prolonged neutropenic patients and stem cell transplantation recipients: a prospective validation. Blood, 2001, 97(6):1604-1610.

［4］ Wattal C.Issues in antifungal stewardship: an opportunity that should not be lost. J Antimicrob Chemother, 2017,72(4):969-974.［5］ 孙于谦,黄晓军.血液系统疾病侵袭性真菌病诊治指南解读. 中国循证医学杂志, 2015(07): 761-763.

［6］ Pini P.Evaluation of serum (1≥3)-beta-D-glucan clinical performance: kinetic assessment, comparison with galactomannan and evaluation of confounding factors. Infection, 2016, 44(2):223-233.

［7］ Boch T.Diagnosis of invasive fungal infections in haematological patients by combined use of galactomannan, 1,3-beta-D-glucan,Aspergillus PCR, multifungal DNA-microarray, and Aspergillus azole resistance PCRs in blood and bronchoalveolar lavage samples:results of a prospective multicentre study. Clin Microbiol Infect,2016, 22(10):862-868.

［8］ Talento AF.A prospective study of fungal biomarkers to improve management of invasive fungal diseases in a mixed specialty critical care unit. J Crit Care, 2017,40:119-127.

［9］ 童彤,沈继录,徐元宏.G试验联合GM试验对恶性血液病患者伴侵袭性真菌病的诊断价值研究.中国微生态学杂志,2016,28(10): 1152-1156.

［10］ 刘永林,赵金方,陈婷婷.血清半乳甘露聚糖联合血浆1,3-β-D葡聚糖在诊断侵袭性真菌感染中的应用价值. 中华临床感染病杂志,2014,7(2): 133-136.