天疱疮患者皮损局部异位淋巴结构的病理学特征

周生儒 邹雅茹 刘芝翠 赵肖庆 郑捷 潘萌

200025上海交通大学医学院附属瑞金医院皮肤科

天疱疮是一种自身免疫性大疱性皮肤病，主要分为寻常型天疱疮（pemphigus vulgaris，PV）和落叶型天疱疮（pemphigus foliaceus，PF），而增殖型天疱疮和红斑型天疱疮则分别为它们的亚型。目前公认的天疱疮发病机制为患者外周血中存在针对角质形成细胞细胞间桥粒结构中的桥粒黏蛋白3（desmoglein 3，Dsg3）和（或）桥粒黏蛋白 1（desmoglein 1，Dsg1）的自身抗体，抗原抗体结合，导致细胞间黏附丧失，出现典型的临床和病理表现［1］。虽然，外周血的抗体循环分布于全身，但患者的皮损并非均匀分布于全身，这提示，可能存在另外的局部免疫机制使得头面部、躯干等脂溢部位成为天疱疮皮损的好发部位。研究证实，真皮内免疫细胞在慢性炎症性皮肤病中起了重要作用［2-3］。因此，天疱疮皮损处是否普遍存在淋巴细胞浸润，浸润的淋巴细胞的类型是什么，浸润淋巴细胞与疾病的发病和维持是否相关，是我们研究的重点。我们对上海瑞金医院皮肤科93例PV和PF患者组织病理切片中真皮内淋巴细胞的浸润分布进行了研究，并用免疫组化的方法研究浸润淋巴细胞的类型，分析浸润淋巴细胞与患者外周血抗体滴度的相关性。

资料与方法

一、资料

1.标本来源：天疱疮活检标本及外周血均来源于2014年1月至2016年12月就诊于上海交通大学医学院附属瑞金医院皮肤科的PV患者56例，PF患者37例。病理取材为新鲜皮损，PV患者主要为水疱，PF患者主要为糜烂面或结痂面。所有患者均根据临床表现、组织病理、直接免疫荧光等明确诊断。用于免疫组化正常对照的皮肤组织来自皮肤科门诊手术室志愿者。本研究通过医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

2.主要试剂和仪器：兔抗人CD3多克隆抗体、鼠抗人CD20单抗、鼠抗人CD138单抗、购自丹麦Dako公司；DAB免疫组化试剂盒购自福州迈新生物开发有限公司；抗人Dsg1、Dsg3抗体ELISA试剂盒购自日本MBL公司；iMark酶标仪购自美国Bio-Rad公司；光学显微镜购自德国Zeiss公司。

二、方法

1.天疱疮皮损处淋巴细胞聚集程度评定：收集93例皮肤活检标本经4%甲醛固定，常规切片后HE染色。皮损浸润淋巴细胞统计，参照改良的淋巴细胞聚集程度的等级评定系统进行评定。Grade1定义为径向细胞计数2～5层，Grade2定义为径向细胞计数6～10层，Grade3定义为径向细胞计数 ≥ 11层［4］。若细胞弥散分布，则人为划定边界。若淋巴细胞以椭圆形聚集则取最大最小径向细胞计数的均值。

2.天疱疮皮损处淋巴细胞免疫组化染色：从93例标本中选择8例PV和8例PF样本进行免疫组化染色。考虑受到免疫组化染色敏感性的限制，为保证有足够多的淋巴细胞，在含有Grade2或Grade3淋巴细胞聚集的样本中进行随机选择。分析患者皮损组织中CD3+T细胞、CD20+B细胞、CD138+浆细胞表达及其分布情况。免疫组化步骤均按照试剂说明书进行，所有染色均设阳性对照（扁桃体）和阴性对照（正常皮肤）。免疫组化染色结果判定：CD3、CD20及CD138表达阳性者均为棕色颗粒，CD3表达定位于细胞膜和（或）胞质，CD20、CD138表达定位于细胞膜。光学显微镜（×200）下观察每个淋巴细胞聚集处是否有表达阳性的细胞。

3.ELISA法检测患者血清中特异性自身抗体：用抗Dsg1和Dsg3抗体检测试剂盒，按产品说明书操作，iMark酶标仪在450 nm波长下读取吸光度。

4.统计学方法：用Graphpad 5.0统计软件进行统计分析，淋巴细胞密集程度指数与抗体滴度的相关性采用Spearman相关分析方法计算P值。用非参数Mann-WhitneyU检验比较两组间差异，数据以±sx表示。

结 果

一、天疱疮患者皮损局部淋巴细胞聚集程度判定

对2014年1月至2016年12月就诊于上海交通大学医学院附属瑞金医院皮肤科的PV患者56例，PF患者37例的HE切片进行分析。患者的性别、年龄等临床资料见表1。天疱疮局部皮损淋巴细胞聚集评级的示例见图1。统计数据表明，93例病理切片中，93例（100.00%）病理切片有Grade 1淋巴细胞聚集出现，64例（68.09%）病理切片有Grade 2淋巴细胞聚集出现，10例（10.06%）病理切片有Grade 3淋巴细胞聚集出现。PF和PV具有相似的概率，见表2。

93例患者病理切片（×50）镜头下Grade1、Grade2、Grade3淋巴细胞聚集的个数。每个Grade1淋巴细胞聚集大约有50个淋巴细胞，Grade2大约有200个淋巴细胞，Grade3大约有600个淋巴细胞［5］。然后以此计算每例病理切片下淋巴细胞总数，定义为淋巴细胞密集程度指数。淋巴细胞的密集程度指数在PF（925.24± 127.91，n=37）和PV（1 008.77±141.75，n=56）差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 93例天疱疮患者临床资料

二、PF和PV患者外周血抗Dsg1/Dsg3抗体滴度

用ELISA的方法检测36例PF患者和55例PV患者外周血抗Dsg1/Dsg3抗体滴度，并进行统计分析，结果见表3。

三、淋巴细胞密集程度指数与抗体滴度的相关性分析

分析PF患者外周血抗Dsg1抗体滴度、PV患者外周血抗Dsg1抗体滴度、PV患者外周血抗Dsg3抗体滴度与淋巴细胞密集程度指数的相关性。数据统计分析结果表明，淋巴细胞聚集程度与抗体滴度间无相关关系（图2）。

四、浸润淋巴细胞的类型

通过免疫组化分析，在16例中，全部有CD3+T细胞出现，15例有CD20+B细胞，12例有CD138+浆细胞。在PV患者中，7例有CD20+B细胞出现，6例有CD138+浆细胞出现。在PF患者中，8例有CD20+B细胞出现，6例有CD138+浆细胞出现。图3示1例天疱疮患者皮损处CD3+T细胞、CD20+B细胞、CD138+浆细胞聚集。我们观察镜下Grade 1～3淋巴细胞聚集中是否有CD3+T细胞、CD20+B细胞、CD138+浆细胞出现。发现在Grade 1～3淋巴细胞聚集区域中均含有大量CD3+T细胞，而含有CD20+B细胞的聚集占总数52.80%±5.78%，含有CD138+浆细胞的聚集占总数34.59%±7.42%。CD3+T细胞、CD20+B细胞、CD138+浆细胞在PV和PF的分布差异无统计学意义。

表2 93例天疱疮患者淋巴细胞聚集的病理评级［例（%）］

表3 PF和PV患者外周血抗Dsg1/Dsg3抗体滴度

图1 天疱疮皮损处淋巴细胞聚集程度评级示例 1A：Grade1（HE×400，方框）；1B：Grade 2（HE×400，方框）；1C：代表性Grade3（HE×200，方框）

图2 淋巴细胞密集程度指数与抗体滴度相关性 2A：PF患者淋巴细胞密集程度指数与外周血抗Dsg1抗体滴度无相关性；2B：PV患者淋巴细胞密集程度指数和与外周血抗Dsg1抗体滴度无相关性；2C：PV患者淋巴细胞密集程度指数与外周血抗Dsg3抗体滴度无相关性

图3 天疱疮皮损处浸润淋巴细胞示例（HE×200） 3A：天疱疮皮损处有大量CD3+T细胞；3B：天疱疮皮损处有CD20+B细胞；3C：天疱疮皮损处有CD138+浆细胞；3D：正常对照真皮内有少量CD3+T细胞；3E：正常对照真皮内无CD20+B细胞；3F：正常对照真皮内无CD138+浆细胞

讨 论

天疱疮患者血清中存在抗角质形成细胞桥粒结构的Dsg1、Dsg3抗体，该抗体在引发角质形成细胞间粘附的丧失和水疱形成中起到主要的致病作用。虽然外周血中抗体可以均匀分布于全身皮肤，但是天疱疮皮损并不累及全部皮肤。皮肤是一个重要的免疫器官，也是天疱疮自身免疫的靶器官。皮肤局部免疫细胞的改变与多种皮肤病的发病息息相关。例如，白癜风皮损局部CD8+T细胞与其发病相关［6］，特应性皮炎皮损处CD20+B细胞大量聚集［7］等。天疱疮皮损局部是否也可能存在可以诱发和加重皮损的免疫性机制尚待研究。

我们对瑞金医院皮肤科93例PV和PF患者的病理切片进行了回顾性分析，发现真皮层异位淋巴细胞的浸润具有普遍性，而且在PV和PF之间无显著差别。这说明天疱疮皮损处普遍存在异位淋巴结构。同时我们选择了8例PV患者和8例PF患者进行免疫组化染色，发现在16例样本中，全部有CD3+T细胞出现，15例有CD20+B细胞，12例有CD138+浆细胞。说明T淋巴细胞和B淋巴细胞共同存在于天疱疮皮损处，部分皮损区域存在浆细胞，而浆细胞与IgG共染是阳性的（数据未列出）。因此在天疱疮皮损局部，T细胞有可能促进B细胞分化成浆细胞，浆细胞产生致病性特异性抗体，需要进一步研究。

天疱疮是一种自身免疫性疾病。自身免疫性疾病的靶器官普遍存在异位淋巴结构（ectopic lymphoid like，ELS）［8］。ELS是一种在自身免疫靶器官、感染局部、肿瘤局部形成，而抗原清除后可消失的瞬态结构。ELS的结构具有异质性，它可以类似典型的次级淋巴器官（如淋巴结、扁桃体）即具有生发中心、分离的B细胞及T细胞区、滤泡状树突细胞及典型的高内皮小静脉等特征性结构；也可仅表现为T、B淋巴细胞在局部呈团块状的浸润［9-10］。在类风湿性关节炎的关节滑膜、干燥综合征的唾液腺和泪腺、多发性硬化的中枢神经系统、系统型红斑狼疮的肾脏等自身免疫性疾病的靶器官均存在ELS［8］。这些部位的ELS主要以T、B细胞浸润的形式存在，只有极少的部位存在典型的生发中心结构［11-13］。天疱疮局部的淋巴细胞浸润也是以T、B淋巴细胞成团浸润为主，没有发现类似二级淋巴器官的T、B细胞分区及生发中心结构，部分区域高内皮小静脉染色阳性（数据未列出）。这些特征与其他自身免疫性疾病靶器官的ELS特征较为一致，因此我们认为天疱疮局部的淋巴细胞浸润也是ELS。

目前研究认为,ELS在抗感染免疫和肿瘤免疫中具有保护作用，而在自身免疫和移植免疫中具有致病作用［8］。研究证实在类风湿关节炎的关节滑膜的ELS中，外周辅助型T细胞能够辅助局部B细胞产生抗原特异性抗体，从而可能对于疾病的发生发展有重要作用［14-17］。天疱疮皮损处ELS中是否存在Dsg抗原特异性T细胞辅助抗原特异性B细胞分化为浆细胞，并进一步分泌抗dsg1和（或）dsg3抗体，进而产生免疫病理作用，需要进一步研究。目前我们的研究没有发现天疱疮局部的异位淋巴细胞的浸润程度与外周血抗体滴度具有相关性。这可能是因为切片部位的真皮淋巴细胞密度不能反映出全身皮肤浸润淋巴细胞的程度以及所有皮损的严重程度。进一步对天疱疮皮损处淋巴细胞致病功能的研究可能需要移植皮损至重症联合免疫缺陷小鼠，观察特异性抗体产生及淋巴细胞的存活与增殖。

综上所述，本文主要阐明了天疱疮患者皮损普遍存在大量淋巴细胞浸润，T、B细胞共存并呈团块状浸润，部分皮损处存在CD138+浆细胞，可能形成ELS，参与皮损的发生、发展和加重。ELS的具体构成模式及其功能尚待进一步阐明。

志谢上海交通大学医学院免疫所王宏林教授课题组

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