高脂饲料喂养时间对2型糖尿病肾病大鼠模型的影响

高雪，安至超，何其英，柳红芳

(北京中医药大学东直门医院，北京 100700)

Conflict of interest statement: We declare that we have no conflict of interest statement.

糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病(diabetes mellitus, DM)的慢性微血管并发症之一，严重威胁着患者的生存质量和寿命[1]。胰岛素抵抗及高胰岛素血症是2型DM的特征性表现。研究发现2型DM患者肾脏并发症的发生时间和产生机制都与1型DM不完全相同，肾胰岛素信号转导异常在2型DN的产生中发挥重要作用[2-3]。因此制备更符合人类疾病特点的动物模型成为2型DN研究中的重要环节。单侧肾动脉结扎+高糖高脂饲料喂养+小剂量链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)腹腔注射的三联法是目前应用最广的诱发型2型DN动物模型制备方法[4]，而目前的文献报道中，关于这一模型评价的研究仍然比较缺乏，因此本研究拟通过探索不同高脂饲料喂养时间对2型DN大鼠体重、血糖、胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment-insulin resistance index, HOMA-IR)及尿白蛋白排泄率(urinary albumin excretion rate, UAER)的影响，为改善2型DN的造模方法提供更多的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF级雄性Wistar大鼠80只，体重180-200 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK(京)2012-0001】。本实验在北京中医药大学教育部中医内科学重点实验室屏障动物实验设施内进行【SYXK(京)2015-0001】。高脂饲料配方为常规饲料加20%蔗糖、10%猪油、2.5%胆固醇，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)；血糖仪及试纸(美国强生公司)；大鼠尿微量白蛋白ELISA试剂盒(美国R&D Systems公司)。

1.2 方法

1.2.1 2型DN动物模型建立

所有大鼠适应性饲养一周，随机分为正常对照组(normal control, NC组)10只和造模组70只。正常对照组不予手术处理，造模组按0.33 mL/100 g体重腹腔注射10%水合氯醛麻醉，大鼠背部术前备皮，常规碘伏消毒，左侧背部切口约 1.5 cm，充分暴露左肾，剥离左肾包膜，并结扎左肾动脉，关闭腹腔，缝合切口，术后大鼠每天肌内注射40万单位青霉素，连续3 d。

此后，将所有造模组大鼠按照体重和血糖水平随机分为DN1组(高脂饲料喂养4周)和DN2组(高脂饲料喂养8周)。正常对照组喂以普通饲料，DN1组及DN2组喂以高脂饲料，分别于4周或8周末禁食12 h，予单次腹腔注射STZ 30 mg/kg(0.1 mol/L、pH 4.2)。STZ注射72 h后，尾静脉采血，随机血糖高于16.7 mmol/L者，列入观察对象。

1.2.2 标本采集和检测方法

大鼠每周称重，每两周尾尖采血，葡萄糖氧化酶法检测随机血糖。在高脂饲料喂养后的第8周及第12周，将大鼠转入代谢笼内，不禁食不禁水，收集24 h尿液，计算总尿量后离心(3000 r/min、10 min)。ELISA法检测尿微量白蛋白含量。比较DN1组及DN2组在STZ注射后的相同时间(DN1组第8周与DN2组第12周)及实验开始后的相同时间里(DN1组第12周与DN2组第12周)UAER之间的差异。

实验结束时，禁食不禁水12 h，麻醉后腹主动脉取血，离心(3800 r/min、10 min)后取血清，放免法检测血清胰岛素浓度，全自动生化分析仪检测空腹血糖浓度，计算HOMA-IR，公式：HOMA-IR=空腹血糖水平(fasting blood-glucose, FGB, mmol/L)× 空腹胰岛素水平(fasting insulin, FINS, mIU/L)/22.5。取右肾，分为两份，一份放入4%甲醛里固定，进行病理学观察，另一份置液氮中保存。肾组织常规制片，HE染色，×400光镜观察。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠不同时间点血糖的比较

两组大鼠均在STZ注射1周后开始出现血糖升高，在STZ注射2周后血糖有一定程度的回落，在STZ注射3周后血糖稳定于较高的水平。可见，两组在注射STZ后的血糖变化趋势基本相同。详见表1。

2.2 大鼠体重随时间变化趋势

手术前，各组大鼠的体重差异无显著性(P>0.05)。手术后，DN模型组大鼠的体重明显低于正常对照组(P<0.01)。此后DN模型组大鼠的体重逐渐升高，且在4周时接近正常组。DN1组及DN2组在注射STZ后分别出现了体重增长速度减慢及体重下降的现象。在12周时，DN1组与DN2组的体重均低于正常组(P<0.01)，但DN2组体重略高于DN1组(P<0.01)。说明延长高脂饲料喂养时间能够增加成模后大鼠的体重。详见表2。

表1 各组大鼠血糖随时间变化的比较Tab.1 Comparison of the changes of blood glucose over time in the rats(±s)

注：与正常组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组1比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01。“-”未测，正常对照组每2周测1次血糖。

Note. Compared with the NC group,#P<0.05,##P<0.01; Compared with the DN1 group,▲P<0.05，▲▲P<0.01.“-”The blood glucose was detected every 2 weeks in the NC group.

表2 各组大鼠体重随时间变化的比较Tab.2 Comparison of the changes of body weight over time in the rats(±s)

注：与正常组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组1比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

Note. Compared with the NC group,#P<0.05,##P<0.01; Compared with the DN1 group,▲P<0.05，▲▲P<0.01.

2.3 大鼠血浆胰岛素及胰岛素抵抗指数的比较

对3组大鼠在第12周末的FGB、FINS及HOMA-IR进行比较后发现，DN1组及DN2组的FGB均较正常组明显升高(P<0.01)，FINS明显降低(P<0.01)，两组的HOMA-IR与正常组相比均有不同程度的升高(P<0.05)。而DN1组与DN2组之间的差异无显著性(P>0.05)。详见图1。

注：与正常组比较，#P<0.05,##P<0.01。图1 各组大鼠胰岛素抵抗指数比较图Note. Compared with the NC group,#P<0.05,##P<0.01.Fig.1 Comparison of insulin resistance indexes in the rats

图2 大鼠肾组织的病理改变(HE染色，×400)Fig.2 Pathological changes in renal tissues of rats of diffrent groups(HE staining,×400)

2.4 大鼠尿白蛋白排泄率的比较

在第8周时，DN1组的UAER明显高于正常组，差异有显著性(P<0.01)。在第12周时，DN1组及DN2组的UAER均高于正常组，差异有显著性(P<0.01)，但DN1组与DN2组之间的差异无显著性(P>0.05)。DN1组和DN2组在STZ注射4周后(分别为第8周和第12周)的尿白蛋白排泄率相比较，DN2组高于DN1组，差异有显著性(P<0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠尿白蛋白排泄率的比较

注：与正常组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组1比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

Note. Compared with the NC group,#P<0.05,##P<0.01; Compared with the DN1 group,▲P<0.05,▲▲P<0.01.

2.5 大鼠肾指数的比较

实验结束时，DN1及DN2组肾指数(5.59±0.83及5.06±0.68)均高于正常组(2.94±0.52)，差异有显著性(P<0.01)，并且DN1组肾指数明显高于DN2组，差异有显著性(P<0.05)。

2.6 大鼠肾病理学观察

正常组大鼠肾皮质区肾小球及肾小管形态基本正常(图2 a)。DN1及DN2组大鼠肾组织HE染色切片可见肾小球毛细血管袢肥大，系膜基质增多；肾小囊腔狭窄；肾小管上皮细胞脱落等病理改变(图2b、c)，但DN1组与DN2组均未见结节性硬化。

3 讨论

单侧肾动脉结扎+高糖高脂饲料喂养+小剂量STZ腹腔注射的三联法是目前应用最广的诱发型2型DN动物模型制备方法[4-6]。DN是DM的微血管并发症之一，初期多无明显的临床表现，是以肾小球滤过率增高为主，后期逐渐出现微量白蛋白尿、大量蛋白尿及肾功能不全[1]。因此，2型DM动物模型常需要经过较长的时间才能够表现出较明显的肾损伤[7]。为缩短实验周期，目前采用较多的方法是先手术切除一侧的肾脏，或将一侧的肾动脉进行结扎。相当于先破坏了50%的肾功能，加重了相同条件下剩余肾单位的损伤程度，使DN的发生提前[8-9]。STZ是最常用的致糖尿病药物，它能够通过特异性地破坏胰腺组织，导致胰岛β细胞随机、快速、不可逆的坏死，减少胰岛素分泌量，引起DM的发生[10]。研究表明高糖高脂饲料喂养能够降低实验动物的胰岛素敏感性，诱发胰岛素抵抗[11]。同时使用小剂量STZ腹腔注射，破坏部分胰岛β细胞，造成胰岛素分泌的相对不足，使模型更接近于2型DM[12-13]。在这种造模方法中，高糖高脂饲料喂养时间及STZ注射剂量的不同，都会对模型造成不同的影响[10]。目前的研究中高脂饲料喂养时间从2周到8周不等，甚至更长的可以达到12～15周，STZ注射剂量从15 mg/kg到50 mg/kg不等[12]。魏占英等[14]的研究指出延长高脂饲料喂养时间能够减少STZ的用量，增加成模率，降低死亡率，并且使模型更接近于2型DM。他们认为高脂饲料喂养8周联合30 mg/kg STZ是制备2型DM的最佳组合。

本实验的研究结果显示，在STZ注射4周后，两组大鼠均可出现UAER的升高，且DN2组UAER明显高于DN1组(表3)，DN2组体重也高于DN1组(表2)。表明延长高脂饲料喂养时间能够加重DN大鼠的肾损伤，同时大鼠的体重更接近于正常大鼠，但两组大鼠的血糖水平及增长趋势无明显差异(表1)。在第12周末，DN1组与DN2组肾组织HE染色均可见肾小球毛细血管袢肥大，系膜基质增多；肾小囊腔狭窄等病理改变(图2)，同时DN1组肾指数明显高于DN2组，而两组12周末的UAER之间的差异无显著性。这表明DN1组肾脏的高灌注、高滤过较DN2组重，但DN2组大鼠可能存在更重的肾小球滤过膜损伤。DN1组高血糖持续时间较DN2组长，这说明DN大鼠肾损伤的程度不完全取决于高血糖的持续时间[15]。由于两组胰岛素抵抗指数之间的差异无显著性，因此其胰岛素抵抗状态持续时间的长短可能影响了其肾损伤的程度[16]。一些研究已经指出，胰岛素抵抗是一个独立的肾损伤因素[2, 17]，并不受血糖水平的影响[18]，这与我们的研究结果是相吻合的。因此可以说适当延长高脂饲料喂养时间能够加重DN的疾病程度[19]。但是从整体实验过程来看，如果选择在DN较轻时干预，则高脂饲料喂养4周能够缩短造模周期；但如果选择在DN较重时开始干预，则较短的高脂饲料喂养时间并不能缩短试验周期(第12周时两组的UAER之间的差异无显著性)，在后期还可能需要观察更长的时间。

另一方面，有文献报道认为STZ在大鼠体内的作用并非完全的β细胞特异性，它还会对大鼠的肝、肾产生一定的毒性作用[10]。而延长高脂饲料喂养时间后，由于大鼠体重的增长，可能会增加STZ的注射剂量，加重肝肾损伤。DN造模中所采用的单侧肾动脉结扎手术属于创伤性的干预措施，必然会对大鼠的状态造成影响。我们的研究发现，手术后造模组大鼠体重较正常组大鼠明显降低。此后逐渐增长，在手术后的第4周，造模组大鼠的体重与正常组比较接近，大鼠状态较好。因此STZ注射不应早于术后第4周。综合上述内容，在实验中应根据具体实验目的权衡选择高脂饲料喂养时间。

除此之外，本研究还发现无论是DN1组还是DN2组，在注射STZ后的第2周血糖水平均有小幅度的波动，在第3周之后才稳定在较高的水平。因此对DN模型大鼠的干预应在STZ注射后的第3周后开始。Qinna等[10]的研究也指出在DM大鼠模型中，不同血糖水平的个体会对胰岛素和其它抗糖尿病药物的作用产生不一样的反应。虽然本实验的研究结果显示，DN1和DN2组大鼠的血清胰岛素水平低于正常组，但其HOMA-IR明显升高。这与2型糖尿病的病理特点是相一致的。目前已经明确，在2型DM晚期除胰岛素抵抗之外，尚存在胰岛β细胞的衰竭，可能跟长期的高胰岛素分泌有关[12]。

总而言之，包括大鼠周龄，STZ注射剂量、次数、方式，高脂饲料喂养时间、配方等诸多因素都会对造模效果和模型稳定性造成影响[20]。因此需要有更多的研究关注模型制备的细节问题，为DN领域的研究人员提供决策依据。

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