黄地吉仙片中金丝桃苷含量测定方法的建立

田蜜+陈芳+贺建昌

[摘要] 目的 为了提高黄地吉仙片的质量标准，建立高效液相色谱法（HPLC）测定其菟丝子含量，并对其进行重金属及砷盐的检查。 方法 色谱柱Symmetry C18（5 μm，6 mm×150 mm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸水（18∶82）；流速：1.0 mL/min；检测波长：353 nm；进样量10 μL。参考《中国药典》（2010年）方法对重金属、砷盐进行杂质限量检查。 结果 金丝桃苷在2.0～100.0 μg/mL范围内，与峰面积呈良好的线性关系（R2 = 0.9998），平均回收率为75.61%。重金属小于百万分之十，砷盐小于百万分之二，与《中国药典》（2010年）对中药制剂重金属、砷盐的要求相符。 结论 HPLC测定金丝桃苷含量方法简便，灵敏度高，重复性好，可用于黄地吉仙片中金丝桃苷的含量测定；黄地吉仙片的重金属、砷盐检查符合要求，为临床用药安全提供了依据。

[关键词] 黄地吉仙片；金丝桃苷；高效液相色谱法；含量；重金属；砷盐

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）01（c）-0122-04

[Abstract] Objective To improve the quality standard of Huangdi Jixian Tablets， high performance liquid chromatography （HPLC） method was established to detect the contents of hyperin and the contents of heavy metal and arsenic salt in Huangdi Jiexian Tablets were detected. Methods Symmetry C18 （5 μm， 6 mm×150 mm） column was used. The mobile phase contained acetonitrile and 0.1% phosphoric acid （18∶82）. The flow rate was 1.0 mL/min and the detection wavelength was 353 nm. The injection volume was 10 μL. In addition， the impurity of heavy metal and arsenic salt was also detected according to Chinese Pharmacopoeia （2010）. Results Within the range from 2.0 to 100.0 μg/mL， hyperin presented an ideal linear relationship with the peak areas （R2 = 0.9998）. The average recovery rate was 75.61%. Heavy metal was less than 10 parts per million and arsenic salt was less than 2 parts per million. These results conformed to the requirements of Chinese Pharmacopoeia （2010）. Conclusion HPLC method for determining the content of hyperin is simple， with high sensitivity and good repeatability， which can be used for the content determination of hyperin in Huangdi Jixian Tablets. The contents of heavy metal and arsenic salt are conformed to the requirement， which provides evidence for the safety of clinical medication.

[Key words] Huangdi Jixian Tablets； Hyperin； High performance liquid chromatography； Content； Heavy metal； Arsenic salt

黃地吉仙片为成都军区昆明总医院（以下简称“我院”）研发的医院制剂，由人参、熟地、菟丝子、苍术、鸡血藤等药材制成，具有健脾补肾、益气养阴、活血化瘀、降糖消脂的功效，运用于非胰岛素依赖型糖尿病，并可用于胰岛素依赖型糖尿病的辅助治疗。经临床使用多年，有显著的效果及良好的安全性。原制剂质量标准中仅对君药玄参、人参、佐药大黄和使药黄连、黄芪进行了薄层鉴别，无含量测定项，因此为更好地控制本制剂质量，现对黄地吉仙片的原质量标准进行完善，参考相关文献[1-10]，采用高效液相色谱法（HPLC）测定菟丝子中金丝桃苷的含量。经方法学验证，表明其方法简便，重复性好，灵敏度高。参照《中国药典》（2010年版）[11]重金属检查法和砷盐检查法及相关文献[12-20]，对黄地吉仙片进行重金属及砷盐的检查研究，以了解其重金属及砷盐是否超标，为临床用药的安全提供依据。

1 仪器与试药

WATERS高效液相色谱仪（2695-2487，美国waters）；电子天平（BP121S，德国赛多利斯）；超声机（SY1200-T，上海声源超声波仪器设备有限公司）；密理博纯水机（Z00QSV001，德国默克密理博）。

盐酸小檗碱（中国食品药品检定研究院，110713-201212，含量86.7%）；金丝桃苷（中国食品药品检定研究院，111521-201406，含量92.5%）；甲醇、磷酸为分析纯；乙腈为色谱纯；硝酸铅（分析纯）；酚酞指示剂；硫酸（分析纯）；硝酸（分析纯）；盐酸（分析纯）；醋酸盐缓冲液（pH=3.5）；标准砷贮备液（100 μg/mL）；三氧化二砷（分析纯）；氢氧化钙（分析纯）；碘化钾（分析纯）；氯化亚锡（分析纯）；黄地吉仙片（我院生产，批号：150601、150602、150603）。endprint

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 色谱条件

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈-0.1%磷酸水（18∶82）；检测波长为353 nm。理论板数按金丝桃苷峰计应不低于5000。

2.1.2 样品制备

2.1.2.1 对照品溶液的制备 取对照品金丝桃苷适量，精密称定，用甲醇制成每1 mL含30 μg的溶液，即得。

2.1.2.2 供试品溶液的制备 取本品，研细，精密称定6 g，加80%甲醇50 mL，称重，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）1 h，放冷，称定重量，80%甲醇补足减少的重量，摇匀，滤过，续滤液用0.45 μm的微孔滤膜滤过，即得。

2.1.2.3 阴性对照溶液的制备 取不含菟丝子的阴性样品按“1.2.2.2”同法制备。

2.1.2.4 检测波长的选择 将金丝桃苷对照品溶液（100 μg/mL）在200～400 nm下全扫，254.1 nm及353.2 nm有最大吸收。又因在353 nm下样品的干扰峰最小，所以最终确定扫描波长为353 nm。与《中国药典》（2010年版）[11]菟丝子项下一致。

2.1.3 专属性试验

取阴性对照样品照含量测定方法进行试验，色谱图见图1。结果表明，在对照品主峰相应位置上阴性对照样品无色谱峰，样品与对照品主峰保留时间一致，说明该项检测专属性良好。

2.1.4 线性关系考察

精密称定适量金丝桃苷对照品，用甲醇配置成2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/mL的对照品溶液，注入高效液相色谱仪，进行含量测定。以峰面积（A）为纵坐标（Y），金丝桃苷的浓度（μg/mL）为横坐标（X），绘制标准曲线，得到回归方程：Y = 20455X + 31 162，R2 = 0.9998。结果显示，黄地吉仙片金丝桃苷含量在2.0～100.0 μg/mL范围内线性关系良好。

2.1.5 精密度试验

取浓度为20 μg/mL的金丝桃苷对照品溶液连续测定6次，结果见表1。结果RSD%为0.24%，小于2%。表明该法精密度良好。

2.1.6 重复性试验

取同一批号（150601）样品6份，按照“1.2.2.2”项下供试品制备方法制备测定，结果见表2。RSD为0.83%，小于2%。表明该法重复性良好。

2.1.7 加样回收试验

精密称取同一批（150601）样品6份，分别加入一定量的金丝桃苷对照品，按照“1.2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备，各取10 μL进样，计算加样回收率，结果见表3，金丝桃苷的平均回收率为75.61%，RSD%为2.69%，表明该方法较准确可靠。

2.1.8 稳定性试验

取供试品溶液（150601），分别在0、2、4、6、8 h进样，记录峰面积。结果峰面积平均值为433 579，RSD为0.42%。表明供试品溶液在8 h内稳定。

2.1.9 含量测定

取3批样品，每批样品平行制样2份进行含量测定，结果见表4。

2.2 重金属及砷盐检查

2.2.1 检测方法

参照《中国药典》（2010年版）[11]一部附录重金属检查法（IXE）、砷盐检查法（IXF），进行三批样品中重金属和砷盐的测定，并按测定方法制备仪器空白溶液及试剂，分别按照上述重金属、砷盐的检查方法进行阴性空白样品的测定。

2.2.2 样品测定

2.2.2.1 重金属检查 取3批样品，按上述方法测定，供试品溶液、空白对照溶液的颜色均比对照品溶液浅，测定结果见表5。

2.2.2.2 砷盐检查 取3批样品，按上述方法测定，供试品及空白对照样品的砷斑颜色均比标准砷斑浅，测定结果见表6、图2。

3 讨论

3.1 金丝桃苷的含量测定

从3批样品测定结果看，含量最高为0.1594 mg/g，最低为0.1538 mg/g，平均值为0.1570 mg/g。本品每片重0.3 g，因此，将本品的金丝桃苷含量定为每片不得少于0.3 g×0.1570 mg/g×80%=0.03768 mg。本品每片含菟丝子以金丝桃苷计（C21H20O12），不得少于0.03 mg。

在含量测定中，对流动相乙腈-0.1%磷酸水的不同比例进行了考察，结果以乙腈-0.1%磷酸水（18∶82）为最佳，基线平稳，金丝桃苷的色谱峰分离最好，峰形最好。

在质量标准提升过程中，首先对君药人参进行了人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的含量测定研究。实验结果表明，在对照品出峰處，阴性样品有干扰，因此将人参的含量测定排除，进行了菟丝子中金丝桃苷的研究。

3.2 重金属及砷盐的检查研究

中药新药制剂若重金属<10 ppm，砷盐<2 ppm，可以不收入质量标准中[20]。因此未将此部分列入黄地吉仙片的质量标准中。中药重金属及砷盐的质量控制在种植、制剂、炮制加工、贮藏与运输等全过程都应重视。近些年来，环境污染越来越严重，要控制好中药及其成方制剂的重金属及砷盐等超标的情况，须从源头抓起，因此我院在中药自制制剂的原材料采购时严把关，并从辅料、生产、运输等多个环节控制，保证制剂的质量和安全。

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（收稿日期：2017-10-02 本文编辑：张瑜杰）endprint