核桃青皮活性成分及分离纯化的研究进展

郑渝川，王 超，程建伟，王智鹏，杨 凌*

(1.四川省林业科学研究院，四川 成都 610081；2.荣县林业局，四川 自贡 43100；3.四川师范大学，四川 成都 610068)

核桃属于被子植物门双子叶植物纲胡桃科核桃属植物，原产于欧洲东南部、北美及东亚地区，是古老的坚果之一[1]。核桃属共有21个种，我国产5种：核桃楸(J.mandshuricaMaxim)、野核桃(J.cathayensisDode)、铁核桃(J.sigillataDoda)、河北核桃(J.hopeiensisHu)、胡桃(J.regiaL.)和一个变种[1～2]。青皮是核桃果的外果皮，成熟的核桃青皮呈黑绿色，有不均匀的黑色斑点，内表面为黄白色，没有特殊气味，味苦涩[3]。核桃青皮中有丰富的多酚类物质对人体有益，能有效减少氧化应激和抑制大分子氧化并降低疾病的风险[4～5]，Stampar 等人鉴定了核桃青皮中13种多酚类物质，分别是：绿原酸，咖啡酸，阿魏酸，芥子酸，没食子酸，鞣花酸，原儿茶酸，丁香酸，香草酸，儿茶素，表儿茶素，杨梅酮和胡桃醌[6]。在德国、法国民间曾使用青核桃酒替代吗啡作为止痛药[7]；国内报道，青核桃酒能用于治疗胃病、腹痛及癌症[8～9]。目前我国核桃青皮大部分丢弃，部分农民误将其作为肥料埋入泥土，产生了严重的酚类感化作用，对植物生长和土壤活性造成破坏[10]。利用青皮中丰富的多酚资源极具前景和意义，不仅能防止环境污染，还可以增加果农的收入。综述了国内外对核桃青皮多酚成分、含量以及加工利用的研究现状，为核桃青皮多酚类的提取和加工应用提供全面的认识。

1 核桃青皮中多酚的种类

多酚类是多羟基酚类化合物的总称，广泛存在于蔬菜、瓜果、豆类、茶叶等植物中。多酚在一些植物中有呈色作用，并能促进机体健康，当前被称为第七营养素。多酚的种类和功能见表1。核桃青皮中的多酚主要分为单宁类、萘醌类、黄烷酮类和酚酸类，生理功能有一定的共性：抗菌、抗肿瘤和抗氧化。

表1核桃青皮中多酚的种类及生理功能

Tab. 1 The types and physiological function of polyphenol in walnut green husk

2 核桃青皮提取物的功能和作用

2.1 抗细菌

Oliveira研究了核桃青皮提取液的抗菌活性，研究结果表明提取液对蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌有高抗菌活性，对铜绿假单胞菌有中等抗菌活性[20]。Keskin等人研究发现，核桃青皮提取液对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌有抑制作用，该研究数据表明核桃青皮提取液能抑制大多数食源性细菌，Keskin等人还使用GC-MS测定了提取液挥发性产物，发现核桃青皮提取液中环氧乙烷占比83.67%，环氧乙烷是有毒的致癌物，因此核桃青皮作为天然抗菌剂还需进一步研究[21]。此外，萃取物中酚类的浓度对抗菌活性影响较小，可能是因为酚类物质成分不同[22]。

2.2 抗真菌

核桃青皮提取液有一定的抗真菌活性，Yigit等人报道核桃青皮水和甲醇提取物对白色念珠菌、光滑念珠菌、热带假丝酵母和高加索乳念珠菌有较好的抑制作用[23]。利用未成熟的核桃青皮汁液治疗皮癣，其效果好于市售抗真菌药，同时，胡桃醌的最小抑菌浓度大于市售抗真菌药十一烯酸锌和硫化硒，因此使用核桃青皮提取物治疗真菌感染安全性可能更高[24]。

2.3 抗氧化

酚类化合物具有氧化还原的性质，可以作为还原剂、自由基清除剂、单线态氧淬灭剂等[25]。植物中，总酚含量与抗氧化活性有正相关性[26]。Rahimipanah等人评价了核桃青提取物对向日葵油抗氧化的能力，认为核桃青皮提取物是优秀的抗氧化剂并能作为食品添加剂，抗氧化成分主要是多酚类物质[27]。

2.4 抗癌

很多研究表明，核桃青皮提取物具有抗肿瘤和癌细胞的活性。核桃青皮乙酸乙酯提取物对白血病细胞K562有较强的抑制活性，并发现核桃青皮中有抗K562细胞的单体物质[28]。Alshatwi等人研究了核桃青皮提取物对人前列腺癌细胞(PC-3)的影响，结果显示核桃青皮提取物能通过抑制该细胞增殖并诱导细胞凋亡[29]。Carvalho等人使用了核桃叶、青皮提取液抑制了人肾癌细胞(A-498，769-P)和结肠癌细胞(Caco-2)的生长活性，但统计学结果表明核桃提取物对癌细胞的抑制能力与其总多酚含量无相关性，表明提取物中特定化学物或一类化学物可能是抗癌症细胞增殖的主要因素[25]。动物实验结果表明：青龙衣粉针剂对小鼠H22肿瘤细胞的生长有明显抑制作用，并随计量的增加而加强[30]。

2.5 其他

核桃青皮中有抗病毒次生活性物质，其提取液能抑制浸染心叶烟的烟草花叶病毒[31]。核桃青皮醇提物也是很好的杀虫剂，对栗叶螨[32]、枸杞蚜虫[33]和萝卜蚜虫[34]触杀率很高，对植物无毒无害、易降解、无残留。

3 影响核桃青皮的分离纯化的因素

3.1 样本性质

不同品种、年份、树龄以及不同的青皮预处理方法都会影响核桃青皮多酚活性物质的提取率。核桃采摘的月份不同，核桃青皮中有效化学成分含量不同，其不同月份青皮中有效成分提取率为8月份>7月份>6月份[35]。不同品种核桃青皮活性成分含量不一，Jupanesti核桃青皮中胡桃醌的含量为42.78 mg/100 g，Vina核桃青皮中含量为20.56 mg/100 g[36]。核桃青皮原料收集后预处理方式对活性成分的影响较大，经过晒干和烘干的核桃青皮其单宁大幅下降，阴干损失较小[12]；

3.2 提取溶剂

多酚类物质易溶于极性大的溶剂，易溶于水、乙醇、丙酮，可溶于乙酸乙酯，不溶于乙醚、氯仿、石油醚等。不同的提取溶剂对其提取率和功能活性有较大影响。许多研究表明，乙醇是提取核桃青皮总多酚提取率最高的试剂，赵建国等人结果显示50%乙醇提取率最高[37]，而王红、李海洋等人认为70%和85%乙醇提取率较高[35,38]。Fernández-agulló等人研究了溶剂对核桃青皮提取物抗菌和抗氧化性能的影响，核桃青皮经冷冻干燥，使用5种萃取溶剂(水，甲醇，乙醇，50%甲醇、50%乙醇水溶液)，提取率按以下顺序增加：乙醇<甲醇<50%甲醇<50%乙醇<水，提取率与溶剂的极性呈正比；提取物抗氧化性能按以下顺序增加：水<乙醇<甲醇<50%甲醇<50%乙醇[39]。不同溶剂萃取山核桃外果皮，其萃取相的抑菌效果差异显著，乙酸乙酯萃取相抑菌效果最差，正丁醇相抑菌效果最好[40]。生产中需根据实际应用目的，选择合适的提取溶剂，总多酚含量与生物活性没有绝对的相关性。

3.3 提取方法

提取试剂的pH值、温度、时间、浓度、体积分数以及原料预处理方法等都是影响提取率的因素，选择最佳的提取方法需要考虑多因素的交互作用。使用一些辅助提取方法能提高提取效率和减少提取时间，例如添加螯合剂、超声波、微波仪器等。赵建国等人以乙醇为提取溶剂，分别采用溶剂提取法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法、六偏磷酸钠(SHMP)辅助提取法提取核桃青皮多酚，结果显示，采用SHMP 辅助微波提取法在70℃、乙醇体积分数50%、液料比25∶1、SHMP添加量为0.6%条件下提取120 min，核桃青皮多酚的得率为4.01 mg·g-1，高于溶剂提取法73.4%[41]。添加EDTA也能提高多酚的提取率：料液比1∶17，EDTA添加量为0.3%，在45℃水浴提取90 min，提取率最高[37]。李海洋通过试验得出的核桃青皮多酚最优提取工艺为：超声辅助提取，乙醇体积分数为85%，时间为55 min，温度为35℃，提取次数为3次，料液比为1∶100[35]。提取溶液中加入果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶也能提高核桃青皮中多酚的提取率，纤维素酶效果最佳[42]。提取方法的优化应综合考虑以下几点：提取成本、提取时间、提取率和环境污染。

3.4 纯化方法

核桃青皮多酚类物质的纯化多使用大孔树脂，张旭等人的研究结果表明，AB-8型大孔树脂对鲜核桃青皮汁多酚的吸附性最好，解吸率最高。最佳条件为多酚质量浓度2.0 mg·mL-1，pH值4.0，上样体积1.6 BV，体积流量2.0 BV·h-1；以70%乙醇洗脱，体积流量2.0 Bv·h-1，体积2.10 BV。在此条件下，其纯度由9.26%提高到52.29%[43]。翟梅枝研究了大孔树脂分离纯化核桃青皮总黄酮的工艺，最优工艺是使用D101大孔树脂吸附分离，上柱总黄酮与树脂质量比为1∶12，上样液质量浓度可在3.09 g·L-1～6.18 g·L-1范围内，pH值为5，6BV(1BV=23.7 mL)的水洗后用5BV的70%乙醇洗脱[44]。马乐等人的试验表明：NKA-9 树脂是分离纯化核桃青皮多酚的最佳树脂，吸附条件为上样液多酚浓度0.574 mg·mL-1，pH值1.0，上样速率1.3 mL·min-1，吸附率可达90.01%；洗脱条件为体积分数50%的乙醇洗脱剂，pH值3.0，洗脱速率0.43 mL·min-1，解吸率达87.9%[45]。

4 展望

至2015年底，四川省核桃种植面积达82.07万hm2，2015年全省产核桃干果40.8万t，年产量居全国第三[46]。不同核桃品种核桃青皮占整果比例约为40%～70%，而由鲜核桃整果加工核桃干果的得率约为20%，据此推算四川核桃青皮年产量约80万t～140万t，以核桃青皮干物质为16%，经分离纯化的多酚提取物干基得率为4.01 mg·g-1计算[41]，将核桃青皮全部用于提取多酚，年产多酚提取物约512 t～912 t，产量和经济效益可观。为了进一步促进核桃青皮加工和利用，对青皮多酚的活性成分、功能以及提取纯化理论和应用的下一步研究提出几点展望：

(1)现有报道对有效成分和药理作用不够深入，难以作为应用支撑，活性成分对某种功能(例如：抗癌)其成分、机理、相互作用、临床试验还有待进一步完善；

(2)总多酚的提取和纯化报告较多，而对核桃青皮多酚单种有效成分的分离纯化研究报道较少，例如 绿原素、咖啡酸、儿茶素等，单种有效成分的分离纯化能提高经济价值、产品质量稳定性和利用范围；

(3)核桃青皮的纯化研究均是提取液直接上树脂，这样会缩短树脂的使用寿命，增加生产成本，在提取液经过树脂前是否需要以增加纯度、去杂、提升树脂使用寿命为目的的前处理还有待研究；

(4)核桃青皮中多酚提取物的相关产品的报道几乎没有，很大程度上限制了核桃青皮的开发及利用，未来需推动核桃青皮多酚产品的研发、安全性评估、标准制定等工作；

(5)我国核桃产区分布广且多在山区，核桃鲜果加工多为小规模人工处理，核桃青皮原料的收集和保存成为制约核桃青皮开发利用的决定性因素。因此，核桃青皮原料的收集和保存方式研究有待进一步深入开展。

[1] 郗荣庭,张毅萍.中国核桃[M].中国林业出版社,1992.

[2] 姚焕英,唐静成,张鞍灵,等.核桃属植物化学成分及生物活性研究[J].西北植物学报,2003,23(9):1650～1655.

[3] 周正.世界主要用材树种概论[M].中国林业出版社,1997.

[4] Silva B M,Andrade P B,Valentão P,et al.Quince (Cydonia oblonga Miller) fruit (pulp,peel,and seed) and jam:antioxidant activity.[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry,2004,52(15):4705.

[5] Pulido R,Bravo L,Saura-Calixto F.Antioxidant activity of dietary polyphenols as determined by a modified ferric reducing/antioxidant power assay.[J].J Agric Food Chem,2000,48(8):3396～3402.

[6] Stampar F,Solar A,Hudina M,et al.Traditional walnut liqueur-cocktail of phenolics.[J].Food Chemistry,2006,95(4):627～631.

[7] 杜旭,李玉文,倪雁,等.中药青核桃镇痛作用研究与展望[J].中国中药杂志,2000,25(1):7～10.

[8] 董再冉.核桃酒治疗腹痛和胃痛[J].中国医刊,1966(7).

[9] 黄织女.青核桃泡酒治肺癌[J].老同志之友,2014(9):61.

[10] 林开敏,叶发茂,林艳,等.酚类物质对土壤和植物的作用机制研究进展[J].中国生态农业学报,2010,18(5):1130～1137.

[11] 何强,姚开,石碧.植物单宁的营养学特性[J].林产化学与工业,2001,21(1):80～85.

[12] 王全杰,李超,王纯,等.核桃青皮中单宁的类型及含量测定[J].皮革与化工,2011,28(3):25～27.

[13] Binder R G,Benson M E,Flath R A.Eight 1,4-naphthoquinones from Juglans[J].Phytochemistry,1989,28(10):2799～2801.

[14] 温文兵,刘淑萍.青龙衣中胡桃醌的研究进展[J].河北联合大学学报(自然科学版),2011,33(1):141～144.

[15] Cushnie T P T,Lamb A J.Antimicrobial activity of flavonoids.International Journal of Antimicrobial Agents[J].2005(26):343～356

[16] 曲中原,邹翔,管小玉,等.青龙衣不同萃取部位化学成分GC-MS分析[J].中草药,2010,41(10):1625～1626.

[17] Colaric M,Veberic R,Solar A,et al.Phenolic Acids,Syringaldehyde,and Juglone in Fruits of Different Cultivars of Juglans regia L.[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry,2005,53(16):6390～6396.

[18] 蔡德海,许立,陈虹,等.青龙衣的抗真菌作用及有效成分[J].武警后勤学院学报(医学版),2009,19(4):274～279.

[19] 张建斌,柳军玺,查飞,等.青龙衣的化学成分研究[J].中草药,2009,40(6):847～849.

[20] Oliveira I,Sousa A,Ferreira I C,et al.Total phenols,antioxidant potential and antimicrobial activity of walnut (Juglans regia L.) green husks.[J].Food & Chemical Toxicology An International Journal Published for the British Industrial Biological Research Association,2008,46(7):2326.

[21] Keskin D,Ceyhan N,Ugur A.Chemical composition and in vitro antimicrobial activity of walnut (Juglans regia) green husks and leaves from West Anatolia[J].Journal of Pure & Applied Microbiology,2012,6(2):583～588.

[22] Pereira J A,Oliveira I,Sousa A,et al.Bioactive properties and chemical composition of six walnut (Juglans regia L.) cultivars.[J].Food & Chemical Toxicology,2008,46(6):2103～2111.

[23] Yieit D,Yigit N,Aktas E,et al.Antimicrobial activity of walnut (Juglans regia L.)[J].Turk Microbiol Soc,2009,1～2(39):7～11.

[24] Clark A M,Jurgens T M,Hufford C D.Antimicrobial activity of juglone.[J].Phytotherapy Research,1990,4(1):11～14.

[25] Costa R M,Magalhães A S,Pereira J A,et al.Evaluation of free radical-scavenging and antihemolytic activities of quince ( Cydonia oblonga ) leaf:A comparative study with green tea ( Camellia sinensis )[J].Food & Chemical Toxicology An International Journal Published for the British Industrial Biological Research Association,2009,47(4):860.

[26] Yang S,Guo K,Li J,et al.Framework Formation of Financial Data Classification Standard in the Era of the Big Data[J].Procedia Computer Science,2014,30(0):88～96.

[27] Rahimipanah M,Hamedi M,M M.Antioxidant activity and phenolic contents of Persian walnut (Juglans regia L.) green husk extract[J].Afr.J.Food Sci.Technol,2010,1(4):105～111.

[28] 李福荣,王庆国,韩纪举,等.青龙衣有效成分的初步提取分离及体外抗肿瘤活性研究[J].时珍国医国药,2011,22(3):608～609.

[29] Alshatwi A A,Hasan T N,Shafi G,et al.Validation of the Antiproliferative Effects of Organic Extracts from the Green Husk of Juglans regia L.on PC-3 Human Prostate Cancer Cells by Assessment of Apoptosis-Related Genes.[J].Evidence-based Complementary & Alternative Medicine (eCAM),2012,2012(2):103026.

[30] 杨志宏.青龙衣粉针对肿瘤细胞抑制作用的实验研究[D].黑龙江省中医研究院,2003.

[31] 景炳年.核桃次生物质抗烟草花叶病毒活性的研究[D].西北农林科技大学,2007.

[32] 陈卫东,李建飞,吴桂军.核桃青皮萃取物防治板栗叶螨试验[J].河北果树,2009(5):8.

[33] 梁永锋.核桃青皮提取物对枸杞蚜虫的触杀和拒食活性研究[J].河南农业科学,2010,39(11):70～72.

[34] 梁永锋.核桃青皮提取物对萝卜蚜虫毒杀和拒食活性研究[J].江苏农业科学,2011,39(2):187～188.

[35] 李海洋.核桃青皮有效化学成分及抑菌性研究[D].西北农林科技大学,2012.

[36] Cosmulescu S N,Trandafir I,Achim G,et al.Juglone content in leaf and green husk of five walnut (Juglans regia L.) cultivars.[J].Notulae Botanicae,Horti Agrobotanici,Cluj-Napoca,2011,39(39):237～240.

[37] 赵国建,席东亮,段江莲.核桃青皮多酚提取工艺优化[J].陕西农业科学,2013,59(04):3～5.

[38] 王红,李永霞,刘军海.超声波辅助提取核桃青皮中单宁的研究[J].现代农业,2011(08):81～85.

[39] Fernándezagulló A,Pereira E,Freire M S,et al.Influence of solvent on the antioxidant and antimicrobial properties of walnut (Juglans regia L.) green husk extracts[J].Industrial Crops & Products,2013,42(1):126～132.

[40] 马良进,林君阳,李桥,等.山核桃外果皮中的抑菌活性成分[J].林业科学,2009,45(12):90～94.

[41] 赵国建,王向东,王焕.提取方法对核桃青皮多酚提取效果的影响[J].农业工程学报,2012(S1):351～355.

[42] 伏慧慧,谭梅,郭艳秋,等.响应面法优化“酶法-超声波”连续提取核桃青皮多酚[J].食品研究与开发,2015(7):42～47.

[43] 张旭,陈丹,曹丽娟,等.5种大孔树脂纯化鲜核桃青皮汁多酚工艺的比较[J].中成药,2016(08):1852～1855.

[44] 翟梅枝,郭琪,贾彩霞,等.大孔树脂分离纯化核桃青皮总黄酮的研究[J].生物质化学工程,2008(03):21～25.

[45] 马乐,韩军岐,白欢欢,等.采用大孔树脂分离纯化核桃青皮中多酚[J].食品与发酵工业,2016(03):237～242.

[46] 程文雯,向朝伦.《四川核桃产业发展报告》发布 种植面积全国第二 产量全国第三[EB/OL].http://www.sc.gov.cn/10462/10464/10797/2016/8/30/10393915.shtml.