不同储藏年限绒柄牛肝菌紫外&红外光谱数据融合鉴别研究

张钰，李杰庆，李涛，刘鸿高，王元忠

（1.云南农业大学农学与生物技术学院，云南昆明 650201）（2.云南省农业科学院药用植物研究所，云南昆明650200）（3.玉溪师范学院资源环境学院，云南玉溪 653100）

随着食品储藏时间增加，微生物增殖、物理及化学变化等因素，导致其商品品质发生改变[1]。野生食用菌生长受季节限制，为整年供应，销售商将采收后的野生食用菌进行加工处理（干燥、脱水等），限制微生物繁殖速度[2]。加工处理过程未对野生食用菌进行灭菌处理，储藏较长时间会引起其内部微生物大量繁殖，产生胺类、硫醇、硫化氢和吲哚等化合物，对人体健康造成危害[1,3]。挥发性物质是影响野生食用菌风味的关键[4]，储藏过程中受温度、光照等因素的影响，挥发性风味物质可能挥发或被氧化，从而影响野生食用菌口感[5,6]，使野生食用菌超过最佳食用期限。由此可见，研究不同储藏年限的野生食用菌干品差异对保证其品质具有重要意义。

紫外（UV）光谱与傅里叶变换红外（FT-IR）光谱技术具有准确度高、灵敏可靠和简便快速等特点，广泛应用于中草药和食品鉴别研究[7～10]。与单一仪器相比，多源光谱数据融合能够反映更多样品化学信息，更加全面解释样品属性，从不同的层面反映样品间差异[11]，可以提高样品分类准确率。Biancolillo等[12]采取中级数据融合策略将五种光谱融合，成功鉴别了不同地区的意大利啤酒，提高了样品分类准确率。Sun等[13]将近红外与中红外光谱进行数据融合，准确鉴别大黄的真伪品。Dankowska[14]将荧光光谱数据与 UV数据融合，对可可脂掺假进行有效鉴别。数据融合对不同种类、不同产地和不同部位等方面研究较多，对不同储藏年限样品研究相对较少，因此本文对不同储藏年限绒柄牛肝菌进行研究。

中国有牛肝菌28属，397种，其中199种为可食用物种[15]。云南牛肝菌资源丰富，共有224种，可食用物种有 144种，可食用牛肝菌种类占全国的72.36%[16]。绒柄牛肝菌（Boletus tomentipes）隶属于牛肝菌科（Boletaceae），又名毛脚牛肝菌、黑牛肝[2]。其子实体富含蛋白质、多糖、核苷类、三萜类等有机化合物，具有抗氧化损伤、抗肿瘤、免疫调节及抗炎症的作用[17～22]，其独特的风味和低糖、低盐、低脂肪等特点被誉为“天然营养健康的多功能食品”，受到越来越多消费者青睐[23]。

本研究采集5个储藏年限，77个绒柄牛肝菌子实体的UV与FT-IR光谱，将预处理后的数据进行偏最小二乘判别分析（Partial least squares discriminant analysis，PLS-DA），分别建立UV、FT-IR、低级数据融合与中级数据融合模型，比较四种模型分类正确率，确定最佳分类模型，建立快速鉴别不同储藏年限绒柄牛肝菌的方法，以期为野生食用菌的品质评价提供一种新思路。

1 实验部分

1.1 实验材料

不同储藏年限绒柄牛肝菌样品分别于 2011、2012、2014、2015和2016年采集（表1），均由云南农业大学刘鸿高教授鉴定为绒柄牛肝菌（Boletus tomentipes Earle）。样品采集后去除杂质，清水洗净，50 ℃烘干至恒重。样品粉碎后，过60目筛，保存于自封袋中备用。

表1 不同储藏年限绒柄牛肝菌样品Table 1 Samples of Boletus tomentipes with different storageperiods

1.2 仪器与试剂

UV-2550紫外可见光分光光度计（日本岛津公司）、傅里叶红外光谱仪（美国珀金埃尔默公司，配有DTGS检测器）、YP-2型压片机（上海市山岳科学仪器有限公司）、60目不锈钢筛盘（浙江上虞市道墟五四仪器厂）、SY3200-T超声波清洗仪（上海声源超声波仪器设备有限公司）、奥豪斯电子分析天平（梅特勒-托多仪器有限公司）、Milli-Q Academic纯水系统（美国密理博公司）、双圈定性滤纸（杭州沃华滤纸有限公司）、101A-1型电热鼓风恒温干燥箱（上海市崇明实验仪器厂）、溴化钾（分析纯；天津市风船化学试剂科技有限公司）、氯仿（分析纯；云南汕滇药业有限公司）。

1.3 紫外光谱的采集

准确称取0.07 g样品于25 mL试管中，加入8 mL氯仿，超声提取30 min后过滤得氯仿提取液。紫外光谱扫描范围230～600 nm，采样间隔1.0 nm，狭缝宽1.0 nm。测定前空白氯仿溶液作为参比溶液与测试溶液进行基线校正。然后测定不同样品提取液UV光谱。

1.4 红外光谱信息采集

称取样品1.5±0.2 mg，溴化钾100±2 mg，置于玛瑙研钵中混合研磨成细粉，将细粉倒入模具中压成厚度均匀的薄片。将仪器分辨率设置为4 cm-1，扫描范围4000～400 cm-1，预热30 min后测定光谱，扫描前使用空白片去除背景中二氧化碳和水的干扰，样品重复测定3次，取平均光谱。

1.5 数据处理

采用Omnic 8.2软件对样品FT-IR光谱进行吸光度转换、纵坐标归一化、自动基线校正处理，SIMCA13.0+软件对样品FT-IR和UV光谱进行卷积平滑（Savitzky-Golay，SG）、标准正态变换（Standard normal variate，SNV）、正交信号校正（Orthogonal signal correction，OSC）、多元散射校正（Multiplicative scatter correction，MSC）、一阶导数（First-derivative，1-D）和二阶导数（Second-derivative，2-D）处理，以及对实验数据进行PLS-DA。Origin 8.0软件绘制UV、FT-IR光谱图。

2 结果与讨论

2.1 不同储藏年限牛肝菌UV光谱分析

2.1.1 绒柄牛肝菌UV光谱

图1 不同储藏年限绒柄牛肝菌平均紫外光谱Fig.1 Average UV spectra of B. tomentipes with different storage periods

图1为5个储藏年限绒柄牛肝菌，在240～400 nm波长范围的平均UV光谱图，在波长263、273、283与295 nm处有特征吸收峰，不同储藏年限样品的UV光谱峰形差异较大，储藏1年样品峰形不同于其它四类样品。储藏2年与3年、5年与6年样品峰形相似，特征吸收峰的吸光度不同。储藏5年与6年样品的光谱在263 nm处的波峰比其它三类样品更明显。表明以氯仿为溶剂的样品提取液中低极性化合物含量可能存在差异。

2.1.2 PLS-DA分析

PLS-DA是基于偏最小二乘回归的一种有监督的判别分类方法，利用自变量矩阵X和分类变量Y建立回归模型。Q2表示PLS-DA模型预测能力的累计百分比，Q2越大模型预测能力越好[24]，R2Y为主成分累积贡献率。不同方法处理样品原始光谱后，结合PLS-DA分析，比较预处理方法对分类的影响，选择最佳预处理方法。由PLS-DA模型可知，四个模型前5个主成分的 Q2均为最大值，通过比较不同预处理方法的PLS-DA模型前5个主成分的Q2、R2Y值（表2），确定最佳预处理方法。SG+2-D处理后前5个主成分Q2、R2Y最大，分别为56.44%、68.22%。表明选择SG+2-D对样品紫外光谱进行预处理，可以改善样品分类效果。

图2 不同储藏年限绒柄牛肝菌紫外光谱PLS-DA得分图Fig.2 PLS-DA score plot of B. tomentipes with different storage periods by UV

牛肝菌样品UV光谱经SG+2-D预处理后，进行PLS-DA分析，图2为UV光谱PLS-DA三维得分图，储藏年限为1年、2年和3年的牛肝菌样品无法被区分，表明储藏年限较短样品（1、2和3年）相似度较高，其低极性化合物含量可能变化较小。储藏年限较长（5和6年）与较短的样品基本能区分，表明随着储藏年限的增加，其低极性化合物含量可能变化较大。

表2 不同方法预处理紫外光谱后PLS-DA模型Q2值和R2YTable 2 Q2 and R2Y of PLS-DA models of UV spectra with different pretreatment

2.2 不同年份绒柄牛肝菌FT-IR光谱分析

2.2.1 FT-IR光谱分析

图3为不同储藏年限绒柄牛肝菌的平均FT-IR光谱。由图可知，不同储藏年限样品FT-IR光谱在3353、2931、1646、1545、1384、1079 cm-1等附近有明显特征吸收峰，3353 cm-1附近主要为O-H与N-H伸缩振动吸收峰；2931 cm-1附近为亚甲基C-H反对称的伸缩振动吸收峰；1646 cm-1附近主要为蛋白质酰胺I带的C-O伸缩振动吸收峰；1545 cm-1附近主要为蛋白质酰胺II带的C-O伸缩振动；1384 cm-1附近为亚甲基的弯曲振动；1079～1031 cm-1吸收峰为C-O和C-C伸缩振动[25]。以上特征吸收峰反映牛肝菌样品糖类、蛋白质、氨基酸和维生素等化合物[26]，其特征峰的吸收强度和位置的差异，表明样品间这些物质含量可能存在差异。

图3 不同储藏年限绒柄牛肝菌的平均红外光谱Fig.3 Average FT-IR spectra of B. tomentipes samples with different storage periods

2.2.2 PLS-DA分析

图4 绒柄牛肝菌红外光谱PLS-DA得分图Fig.4 PLS-DA score plot of B. tomentipes samples by FT-IR

受仪器噪音、实验环境、样品差异等因素干扰，原始光谱中包含大量无关信息。采用基线校正、纵坐标归一化、MSC、SNV和2-D对原始光谱进行预处理，能有效的减少噪音的干扰，减小基线漂移对模型的影响，放大和区分重叠谱带的化学信息[27]。将预处理后的光谱数据导入SIMCA-P+13.0软件定性识别，比较不同预处理方法的分类效果，选择最佳预处理方法。表3为不同方法预处理红外光谱后PLS-DA模型Q2最大值，及其对应 R2Y值。经 SG+1-D预处理后PLS-DA模型前11个主成分Q2最大，为67.87%，R2Y为87.93%。1-D+SNV预处理后PLS-DA模型前15个主成分 Q2最大，为 71.21%，R2Y为 92.94%。SG+2-D+MSC预处理后PLS-DA模型前13个主成分Q2最大，为77.42%，R2Y为93.98%。SG+2-D+SNV预处理后 PLS-DA模型前 13个主成分Q2最大，为77.44%，R2Y为94.02%。SG+2-D+SNV预处理后Q2与R2Y值均大于其它方法，表明SG+2-D+SNV为最佳光谱预处理方法。

对牛肝菌样品光谱进行SG + 2-D + SNV处理后，进行PLS-DA分析，图4为77个牛肝菌样品PLS-DA得分图，储藏年限2年、5年和6年样品能很好的区分开，储藏年限1年与3年样品不能很好的聚为一类。难以区分不同储藏年限牛肝菌样品。

表3 不同方法预处理红外光谱后PLS-DA模型Q2最大值Table 3 Q2 and R2Y of PLS-DA models of FT-IR spectra with different pretreatment

2.3 数据融合分析

图5 绒柄牛肝菌低级数据融合PLS-DA得分图Fig.5 PLS-DA score plot of B. tomentipes by low-level data fusion

图6 紫外光谱PLS-DA R2Y、Q2累积图Fig.6 R2Y and Q2 plot of PLS-DA of UV spectra

图7 红外光谱PLS-DA R2Y、Q2累积图Fig.7 R2Y and Q2 plot of PLS-DA of FT-IR spectra

图8 绒柄牛肝菌中级数据融合后PLS-DA得分图Fig.8 PLS-DA score plot of B. tomentipes by mid-level data fusion

低级数据融合，将预处理后的UV与FT-IR数据归一化后直接串联，得到一个新的数据矩阵，建立PLS-DA模型进行鉴别分析。图5为77个样品主成分三维得分图，由图可知储藏5年部分样品与1年样品混在一起，较难区分开，其它几个储藏年限样品均很好的聚为一类。

中级数据融合前对多源光谱数据进行PLS-DA降维，挖掘出与牛肝菌储藏年限差异有关的信息。在预处理的基础上，对原始数据中利于分类的特征变量进行挖掘，将筛选的两组数据进行连接，得到新的数据矩阵，建立PLS-DA模型。从UV与FT-IR的R2Y、Q2累积图(图6、7)可知，UV与FT-IR模型前5个与前13个主成分Q2最大，模型的预测能力最好，提取模型前5个与前13个主成分为特征变量。将提取的特征变量进行融合建立PLS-DA模型。

图8为中级数据融合后的PLS-DA三维得分图，五个储藏年限样品可被明显区分，且同一储藏年限的样品聚类效果好，每一类样品均聚类集中，仅储藏年限3年的3-11、3-12、3-13样品不能与同一储藏年限样品聚为一类。相较于UV、FT-IR和低级数据融合策略，中级数据融合策略对不同储藏年限样品的分类效果最好，能将相似度较高的样品进行区分，可以用于不同储藏年限的绒柄牛肝菌的鉴别。

2.3.1 不同模型分类结果比较分析

随机选择 1-1～1-4、2-13～2-16、3-3～3-4、3-11～3-13、4-6～4-9、4-16～4-18、5-4～5-6，23个样品作为预测集，其余54个样品为训练集，采用UV、FT-IR、低级数据融合和中级数据融合策略，分别建立PLS-DA模型。当训练集与预测集的预测值在 0.5～1.5范围，样品分类正确，预测值越接近于1，分类效果越好，小于0.5或大于1.5的样品分类错误[28]，不同类型模型的预测结果见表4，中级数据融合策略样品错判数最少，仅3个分类错误。

单独采用UV建立分类判别模型效果最差，10个样品分类错误，通过比较四种模型，中级数据融合策略分类效果最佳，训练集、预测集和样品的分类准确率均最高。

评价 PLS-DA模型训练集常用的参数有 R2cal、RMSECV。当内部验证决定系数（Internal validation determines the coefficients，R2cal）越接近于1，内部交叉验证均方根误差（Root mean squares error of cross-validation，RMSECV）越小，训练集的模型预测能力越好[29]。

从表5可知，五个储藏年限样品R2cal、RMSECV平均值中，中级数据融合的R2cal平均值最接近于1、且RMSECV平均值最小；只采用紫外光谱进行鉴别时，R2cal平均值最小，RMSECV最大。综上表明，采用中级数据融合策略能区分相似度较高的样品，分类效果最佳。

通过利用UV、FT-IR、低级数据融合和中级数据融合模型，对不同储藏年限绒柄牛肝菌进行鉴别，结果显示不同模型分类准确率，中级数据融合>低级数据融合>FT-IR>UV，数据融合策略优于采用一种光谱分类效果，这与Anibal C V D[30]等、Márquez C[31]等掺假鉴别研究相似。

低级数据融合模型受无关信息影响，降低模型性能[32]，中级数据融合对原始数据中利于分类的特征变量进行挖掘，中级数据融合分类效果优于低级数据融合。因此中级数据融合也可以用于不同储藏年限样品的鉴别；UV、FT-IR、低级数据融合PLS-DA模型，储藏年限较短的几类样品混在一起，不易区分。与周琼琼[33]等、Ning J M[34]等对茶储藏年限研究结果相似，储藏年限较短的样品中内含物质含量无显著变化。随储藏年限增加，样品内蛋白质、可溶性糖等内含物质含量可能减少。

表4 不同模型的预测结果Table 4 Forecasting results of different models

表5 不同模型的R2cal和RMSECVTable 5 R2cal and RMSECV of different models

3 结论

采用FT-IR和UV光谱法，测定5个不同储藏年限绒柄牛肝菌的FT-IR和UV光谱，运用SG、1-D、2-D、OSC、MSC、SNV预处理方法对原始光谱进行优化处理，结果显示SG+2-D+SNV和SG+2-D分别为FT-IR和UV光谱的最优预处理，UV、FT-IR、低级和中级数据融合PLS-DA模型，总样品分类错误数分别为 10、6、4、3，中级数据融合>低级数据融合>FT-IR>UV，中级数据融合显示出更高的分类正确率。说明数据融合策略利用不同来源数据的互补性，增加样品化学信息，从不同的层面反映牛肝菌个体差异，相较于单一仪器数据融合显示出更高分类正确率。中级数据融合对原始数据中分类有关信息进行挖掘，相较于低级数据融合分类效果更好。中级数据融合策略结合PLS-DA为不同储藏年限绒柄牛肝菌的鉴别分析提供了方法，同时为其品质保证提供了新思路。

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