流式细胞术及PCR技术在儿童急性B淋巴细胞白血病微小残留病监测中的价值*

唐 雪 ，宪 莹 ，温贤浩 ，郭玉霞 ，管贤敏 ，王世一 ，肖剑文 △（1.重庆医科大学附属儿童医院血液肿瘤中心；2.儿童发育疾病研究教育部重点实验室；3.儿科学重庆市重点实验室；4.重庆医科大学附属儿童医院临检中心，重庆400014）

急性淋巴细胞白血病（ALL）是儿童白血病最常见的亚型，其中 B 细胞性 ALL（B⁃ALL）占 70%～75%，儿童B⁃ALL最常见的白血病基因有ETV6/RUNX1、E2A/PBX1或MLL相关基因等[1]，不同基因型预后有所不同。微小残留病（MRD）是白血病治疗后体内残留白血病细胞的状态，是白血病独立的预后因素[2]。目前主要的 MRD 检测方法有 2种[2⁃3]：流式细胞术（FCM）检测残留白血病细胞表面抗原，即FCM⁃MRD；聚合酶链式反应（PCR）技术检测初诊时存在的白血病基因表达，即PCR⁃MRD。本研究针对初诊时 ETV6/RUNX1、E2A/PBX1或MLL基因阳性B⁃ALL患儿采用FCM及PCR技术监测MRD，分析2种方法的灵敏度及特异性是否存在差异，并分析MRD与B⁃ALL预后之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 研究对象为2012年9月至2015年1月重庆医科大学儿童医院收治并接受CCLG⁃ALL⁃2008方案[4]（简称08方案）化疗初诊为B⁃ALL的患儿。本研究得到重庆医科大学儿童医院伦理委员会批准，患儿家属均签订知情同意书。纳入标准：（1）诊断年龄小于18岁；（2）初诊时按WHO⁃2008淋巴及造血组织肿瘤分型标准[5]完善骨髓细胞学、免疫分型、染色体核型分析及融合基因检查；（3）ETV6/RUNX1、E2A/PBX1 或 MLL基因阳性。排除标准：（1）入院前接受过抗白血病治疗；（2）成熟B⁃ALL及混合细胞白血病；（3）继发性ALL或合并其他肿瘤；（4）初诊时合并中枢神经系统白血病和（或）睾丸白血病；（5）确诊前死亡，或确诊后放弃治疗，或非疾病因素未完成1个疗程化疗。

1.2 方法

1.2.1 检测方法 按照08方案，所有患儿在不同时间点（TP），即TP1（诱导缓解疗程第15天）、TP2（诱导缓解第33天）、TP3（巩固治疗第1天）时采集骨髓进行检测。

1.2.1.1 骨髓细胞学 TP1、TP2及TP3均进行骨髓细胞学检测。骨髓液涂片5～8张并分类计数至少200个有核细胞，幼稚细胞比例小于5%为M1型，幼稚细胞比例5%～25%为M2型，幼稚细胞比例大于25%为M3型。

1.2.1.2 FCM⁃MRD 在TP2及TP3采用FCM技术检测MRD。采集EDTA抗凝骨髓液2 mL并分离单个核细胞（MNC），每管加入1×106个细胞，根据初治时免疫表型选择个体化检测抗体组合，每种单抗20µL，混匀后室温避光15 min，加入1倍溶血素裂解红细胞，离心，弃上清。PBS洗涤1次，加入500µL PBS使用四色流式细胞仪检测。出现下述情况则定义为MRD阳性[2]：正常表达抗原强度改变（增强或减弱）和（或）丢失、异常表达其他系别标志、早期和晚期抗原同时表达、幼稚细胞比例明显增多且均质性表达等。以这些残存细胞占骨髓MNC 总数的比例作为 MRD 的数值，FCM⁃MRD＜10⁃4为阴性。

1.2.1.3 PCR⁃MRD 在TP2、TP3时采用PCR技术检测MRD。EDTA抗凝骨髓液分离MNC并提取细胞总RNA，逆转录为cDNA。初诊MLL阳性者经逆转录PCR（RT⁃PCR）技术扩增后聚丙烯酰胺凝胶电泳及染色分析，出现阳性条带为 PCR⁃MRD阳性[6]。初诊ETV6/RUNX1或E2A/PBX1阳性者实时荧光定量PCR（qRT⁃PCR）检测标本基因拷贝数，用已知浓度的标准品和待测标本中ABL浓度作为对照，得出待测标本基因拷贝数、基因拷贝数与ABL浓度比值，基因拷贝数小于10-5为 PCR⁃MRD 阴性[7⁃8]。

1.2.2 治疗方案及危险度分组 患儿按照08方案进行危险度分组[4]并接受治疗。（1）标危（SR）组必须同时满足以下条件。①初诊年龄1～＜10岁；②初诊WBC≤50×109L-1；③无以下染色体改变和（或）基因检出：t（9；22）或BCR/ABL基因、11q23相关异常或MLL基因重排、t（1；19）或 E2A/PBX1 基因；④泼尼松试验[4]敏感（PGR）；⑤TP1骨髓细胞学结果为非M3型、TP2时骨髓细胞学结果完全缓解且 FCM⁃MRD＜10-4。（2）高危（HR）组满足以下条件之一。①t（9；22）或BCR/ABL基因阳性；②11q23相关异常或MLL基因重排阳性；③泼尼松试验不敏感（PPR）；④初诊IR患儿TP1骨髓细胞学为M3 型；⑤FCM⁃MRD：TP2时 FCM⁃MRD≥10-2或 TP3时FCM⁃MRD≥10-4。（3）中危（IR）组：既不符合 SR 又不符合HR标准的患儿。

1.2.3 疗效评估标准 患儿随访至2017年2月，疗效以完全缓解（CR）率、无事件生存率（EFS）描述。CR 定义为化疗后无明显白血病症状体征、血常规大致正常且骨髓细胞学为M1[9]。EFS定义为自诊断之日起到第1次事件或末次随访日期，事件包括治疗失败（早期死亡或未达CR）、骨髓和（或）髓外复发、CR期内死亡、发生第二肿瘤及放弃治疗等[9]。

1.3 统计学处理 应用SPSS21.0统计软件进行数据分析，计量资料以中位数、±s表示，采用t检验或单因素方差分析；计数资料以率表示，采用χ2检验分析，标准值小于1采用Fisher确切概率法分析；采用Kaplan⁃Meier生存分析法计算生存率。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 临床资料 共61例患儿纳入本研究，包括ETV6/RUNX1阳性组（A组）34例，E2A/PBX1阳性组（B组）15例及MLL阳性组（C组）12例。A组因诊断时，WBC≥50×109L-1且PPR列入HR组1例，诊断年龄大于或等于10岁列入IR组1例，FCM⁃MRD异常列入IR组3例；B组因PPR及FCM⁃MRD异常列入HR组各1例。基因型分组与危险度分组情况见表1。

表1 患儿危险度分布情况（n）

2.2 不同时间点FCM及PCR检测MRD结果 A组TP2时FCM⁃MRD阳性5例，其中PCR⁃MRD阴性3例。B组TP2时 PCR⁃MRD阳性4例，仅1例 FCM⁃MRD阳性。C组TP2时4例FCM⁃MRD阳性，PCR⁃MRD阳性仅1例。表明治疗早期FCM⁃MRD与PCR⁃MRD并不完全相符。A组TP3时FCM⁃MRD均转阴但仍有1例PCR⁃MRD阳性。B组TP2后复发放弃1例，完成TP3评估14例，FCM⁃MRD均转阴但仍有3例PCR⁃MRD阳性。C组TP2后放弃治疗或失访5例，完成TP3评价7例，FCM⁃MRD及PCR⁃MRD均转阴。虽样本量太少无法进行统计分析，但仍提示PCR⁃MRD治疗后期可能灵敏度高于FCM⁃MRD。见表 2。

表2 不同时间点FCM及PCR检测MRD结果（n）

TP2、TP3时三组患儿共做FCM及PCR监测116例次，FCM⁃MRD阳性 10例次（阳性率为 8.62%），PCR⁃MRD阳性17例次（阳性率为14.66%），PCR⁃MRD阳性率高于 FCM⁃MRD，但差异无统计学意义（P＞0.05）。TP2时FCM⁃MRD阳性率及PCR⁃MRD检查阳性率分别为16.39%和 27.88%，PCR⁃MRD阳性率也高于 FCM⁃MRD，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 疗效评估 61例患儿总CR率为98.36%（60/61），三组 CR率（A、B、C组分别为 100.00%、100.00% 和91.67%）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。A 组均CR，睾丸及中枢复发各 1例，3年EFS为（93.1±4.7）%。B组均CR，TP2时FCM⁃MRD阴性而PCR⁃MRD阳性4例均骨髓复发，FCM⁃MRD及PCR⁃MRD均阴性11例中感染死亡2例，其余9例生存，3年EFS为（60.0±12.6）%。C组1例未CR，11例CR患儿放弃治疗4例，其余7例（FCM⁃MRD及PCR⁃MRD均阴性）中感染及异基因造血干细胞移植死亡各1例，3年EFS为（62.9±17.9）%。随访至2017年2月，所有患儿3年总EFS为（80.0±5.4）%，A 组 EFS均高于 B、C 组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图 1。B 组 PCR⁃MRD 阳性患儿全部复发，而PCR⁃MRD阴性患儿无复发，见图2。

图1 三组患儿EFS比较

图2 B组患儿EFS比较

3 讨 论

白血病是儿童时期发病率最高的恶性肿瘤，B⁃ALL最为常见[1]。随着诊治技术的改进和社会经济发展，儿童B⁃ALL疗效不断提高，治疗达到CR后患儿体内仍剩余的微量残留白血病细胞是导致疾病复发的重要因素[2]，因此，寻找可靠的指标用于检测MRD对于指导白血病治疗非常重要。

初诊时，白血病细胞具有与正常血细胞表达水平、表达时机或组合不同的抗原表达，即白血病相关免疫表型（LAIP）[10]，治疗达到CR后残留白血病细胞一般仍保留其初诊时LAIP。因此，可利用FCM确定初诊时LAIP，定期随访其水平变化可动态监测MRD。FCM⁃MRD 简便快速，但该方法存在若干缺陷[11]：（1）目前尚未发现真正意义上的白血病特异性抗原，LAIP只是基于正常白细胞表面分化抗原的多参数分析，治疗后可能抗原漂移导致假阴性；（2）不同实验室及人员个体化差异大，导致不同中心检测的稳定性较差；（3）FCM需使用新鲜标本，故对检测结果有疑问时试验难以重复。

ETV6/RUNX1、E2A/PBX1及MLL相关基因是儿童B⁃ALL最常见的白血病基因，分别占儿童B⁃ALL的20%～35%、5%～10% 和 5%[12]。融合基因是白血病特异性的分子遗传学标记且是独立的预后因素。因此，初诊时利用PCR技术检测患者存在的融合基因、定期随访该基因表达情况也可以监测MRD[13]，且可以克服FCM技术存在的缺点。

本研究结果显示，治疗早期PCR⁃MRD阳性率虽高于 FCM⁃MRD，但差异无统计学意义（P＞0.05），说明治疗早期根据医院自身条件选择其中一种检测方法均可有效监测MRD并指导治疗。但MLL阳性患儿复发率高和治疗后LIAP容易发生抗原漂移并导致FCM⁃MRD误差，故长期随访时PCR⁃MRD效果可能会优于FCM⁃MRD。本研究结果发现，E2A/PBX1阳性B⁃ALL患儿治疗后FCM⁃MRD早期转阴而PCR⁃MRD阳性者全部复发，提示该基因阳性患儿治疗后选择PCR技术监测MRD可能优于FCM。但PCR技术仅能针对初诊时有特异性白血病基因患儿进行，对于基因检测阴性患儿仍只能采用FCM检测MRD。

总之，使用FCM或PCR技术均可以有效检测儿童B⁃ALL的MRD水平，并指导其分层治疗。但FCM存在的缺陷均可以被PCR技术弥补，而PCR检测为白血病特有标记，因此，对于有特异性白血病基因的患儿，采用PCR技术监测MRD尤其是长期随访时可能优于FCM。

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