食品中N-亚硝胺类化合物检测方法研究进展

（天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，天津300461）

亚硝酸盐广泛存在于食品之中，很容易与胺化合，生成亚硝胺。亚硝胺与苯并芘、黄曲霉素是世界公认的三大强致癌物质[1]。长期小剂量食用含亚硝胺的食品就可以使人致癌[2]。随着人们健康意识的逐步提高，对食品品质要求越来越高，对于食品中的N-亚硝胺类化合物污染问题也越来越受到关注[3]。清华大学陈超副研究员课题组调查全国饮用水供水系统，在水中检查发现了9种亚硝胺类有毒物质，该事件引起了全国范围对亚硝胺的关注[4]。近年来，对N-亚硝胺类化合物分析方法的改进和以快速、准确、环保为目的分析方法的建立与发展，已经成为了食品安全领域的一个研究热点。本文对近几年食品中的N-亚硝胺类化合物分析研究检测方法进行了简要综述。

1 N-亚硝胺类化合物的种类

N-亚硝胺类化合物简称为亚硝胺[5]，通式见图1。当R1和R2相同时，称为对称性亚硝胺，当R1和R2不同时，称为非对称性亚硝胺[6-7]。常见的N-亚硝胺类化合物见表1。

图1 N-亚硝胺类化合物的结构通式Fig.1 Structure of N-nitrosamines

表1 常见的N-亚硝胺类化合物的中文名称、英文名称、CAS编号、分子式、结构式Table 1 The Chinese name，English name，CAS number，molecular formula and structural formula of the common N-nitrosamines compounds

2 N-亚硝胺类化合物的危害

亚硝胺化合物种类繁多，亚硝胺的毒性随着其烃链的延长而逐渐降低。食品中毒性最大的就是NDMA，其主要是造成肝脏损伤和血小板破坏[8]。N-亚硝胺类化合物很少存在于自然界，但亚硝酸盐和胺类却广泛存在[9]。人们通过摄入含有亚硝酸盐和胺类的食物，在胃部一定条件下形成N-亚硝胺类化合物[10-12]，反应方程式见图2。

图2 胺类物质与亚硝酸盐反应生成亚硝胺Fig.2 Amines react with nitrites to form nitrosamines

虽然亚硝胺属于高致癌物[13-14]，但是也没必要过分担心。中国畜产品加工研究会、中国食品科学技术学会及北京大学肿瘤医院等有关专家表示，离开摄入量谈食品的致癌风险是没有意义的，致癌物只是有致癌的潜在风险[15]。比如肉制品加工中会添加亚硝酸盐，加工后会形成亚硝酸胺，如果按照国家标准添加，食用对人体无害。

3 N-亚硝胺类化合物国家限量要求

早在1988年国家卫生部就制定了肉制品中NDMA的限量要求。1999年和2005年国家卫生部及标准化管理委员会重新制定N-亚硝胺类化合物限量标准。标准中检测食品类别增加了海产品，检测项目也增加了NDEA。2012年国家卫生部通过对我国居民近年膳食污染物的暴露量评估分析，又参照国际食品法典委员会（CAC）制定的《食品和饲料中污染物和毒素通用准则》、欧盟委员会No 1881/2006指令、澳新食品标准局制定的《食品法典标准》，颁布了最新的N-亚硝胺类化合物限量标准。N-亚硝胺类化合物检测标准名称和限量要求见表2。

表2 N-亚硝胺类化合物检测标准和限量要求Table 2 N-nitrosamine compounds detection limit requirements and standards

4 常用的N-亚硝胺类化合物的检测方法

4.1 气相色谱法（Gas Chromatography，GC）

GC是检测N-亚硝胺类化合物比较传统的方法，其检测器一般采用火焰电离检测器（Flame Ionization Detector，FID）。彭俏容[20]在测定啤酒中的NDMA中就用到带火焰电离检测器的气相色谱（GC-FID）的检测方法。啤酒样品先进行冷冻熔炼前处理，再上机分析，分析得出NDMA在5 mg/L～200 mg/L范围内具有良好的线性关系（r2=0.999 6），仪器的检出限（Limit of De tection，LOD）为0.51 mg/L，方法的定量限（Limit of Quantitation，LOQ）为 1.26mg/L，在5、10、20mg/L3个加标水平下的回收率分别为84.94%、83.24%、85.14%，平行7次测定的相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）分别为3.06%、3.19%、2.63%。熊凤娇[21]在分析鱼糜制品中挥发性N-亚硝胺含量时，用安捷伦7890A气相色谱仪测定。得到10种鱼糜制品中普遍存在8种挥发性N-亚硝胺：NDMA（0.2μg/kg～18.2μg/kg）、NMEA（0μg/kg～12.8μg/kg）、NDEA（0.6μg/kg～23.6μg/kg）、NDPA（0.2 μg/kg～5.9 μg/kg）、NDBA（0 μg/kg～14.8 μg/kg）、NPIP（0 μg/kg～1.7 μg/kg）、NPYR（0 μg/kg～8.7 μg/kg）及 NMorPh（0.5 μg/kg～5.0 μg/kg）。NDPhA 仅在虾丸中检出，含量为（6.0±1.7）μg/kg。GC虽然分析简便快捷，但由于其必须用已知物与相应的色谱峰进行对比，依靠保留时间定性，缺乏特异性。在样品基质比较复杂的情况下亚硝胺的分析效果不理想。

4.2 气相色谱-质谱联用法（Gas Chromatography-Mass Spectrometry ，GC-MS）

GC-MS不仅利用了色谱高效的分离能力，而且还发挥了质谱好定性的特点，大大提高了定性的准确性，灵敏度比GC-FID大大提高了。GC-MS检测亚硝胺实验条件及检测情况见表3。

4.3 气相色谱—热能分析仪法（Gas Chromatography-Thermal Energy Analyzer，GC-TEA）

热能分析仪是一种氮专属检测器，对氮具有等摩尔响应，灵敏度高、特异性好、线性范围宽等特点。张红[26]等在测定水产品中亚硝胺时使用GC-TEA，样品经蒸馏、萃取、浓缩后上机分析得到四种挥发性N-亚硝胺线性范围是 0.2 μg/mL～4.0 μg/mL，线性相关系数R2最高的是NDMA，R2为0.999 4，方法检出限为0.001 mg/kg。冯新昌[27]使用GC-TEA测定食品中的挥发性亚硝胺，其中108份样品检出亚硝胺，主要为NDMA，平均含量为0.83 μg/kg，在抽检的52份肉制品当中，香肠的亚硝胺平均含量最高，NDMA平均含量为1.10 μg/kg，NDEA 平均含量为 0.005 μg/kg，NPYP 平均含量为0.44 μg/kg。GC-TEA作为现行国标亚硝胺检测的第一法，相比其它检测方法有很大优势。GC使用FID检测器检出限只能达到mg/kg级别，当GC-MS连用后其检出限才能达到ppb级别。由于FID检测器缺乏特异性及灵敏度，在定性和定量亚硝胺时存在着不小的难度，其方法已经被GC-MS取代。GC-MS与GCTEA相比，两个实验方法的灵敏度相同，但在处理基质比较复杂的样品时候，尤其存在相似性质物质干扰时，GC-MS结果的稳定性和重现性就比不上GCTEA，因此在处理基质比较复杂的样品时，GC-MS比GC-TEA要对样品多进行一步净化前处理，实验步骤比GC-TEA麻烦，实验成本也较高。

表3GC-MS检测亚硝胺实验条件及检测情况Table 3 Experimental conditions and detection of nitrosamine by GC-MS

4.4 高效液相色谱-质谱联用法（High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS）

复杂基质样品进行多种亚硝胺成分检测时，使用GC-MS方法很难得到满意结果。有些亚硝胺不易挥发，热稳定性差，GC-MS对于这类亚硝胺无法检测，其次对于含多种亚硝胺、物质成分较为复杂的样品GCMS的分离效果不尽如人意。对于GC-MS这些局限性，HPLC可以更好的分离，尤其是热稳定性差的亚硝胺，而HPLC-MS的联用可以在分离的基础上进行定量分析。用HPLC分析肉制品中亚硝胺类化合物时，洪凰[28]将样品与氯化钠水溶液混合进行蒸馏，馏出液过Ambersorb 572 SPE柱。然后洗脱，氮吹浓缩。浓缩液再进行脱亚硝基化反应后，乙腈定容，过有机滤膜待测。色谱柱选用ODS-2 Hypersil C18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm），柱温 30 ℃，进样体积 50μL，流速 1.0 mL/min，流动相为乙腈-水（体积比55∶45），激发波长350 nm，发生波长530 nm。NDMA检出限为0.5 μg/kg、NDEA和NPIP检出限均为2.0 μg/kg。相比于食品，水中亚硝胺的检测前处理较简单，钱静汝[29]把水样过滤后经固相萃取，浓缩和富集后上液质，得到NDMA在1 μg/L～50 μg/L线性范围内，相关系数R2＞0.998。同样朱翔[30]用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪（Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）检测水中9种亚硝胺，也得到良好的检测结果，9种亚硝胺检出限范围是1.3 ng/L～2.8 ng/L，定量限范围是4.0 ng/L。

4.5 二次展开光解薄层层析法

亚硝胺对光敏感，在光照条件下就可以发生催化降解。Preussmann等率先使用薄层层析法检测亚硝胺。魏天俊等[31]在此基础上提出二次展开光解薄层层析法，其先用无氧乙醚萃取亚硝胺，再将萃取浓缩液滴至活化后的硅胶板上，待溶剂上升到距离原点3 cm～4 cm时，使用无滤光片的紫外分析灯照射10分钟后，再等溶剂上升到距原点10 cm处，喷Griess试剂进行显色。如果样品中含有亚硝胺，则在距原点不足3cm处就有玫瑰红色斑点出现。

5 展望

食品中可能存在的N-亚硝胺类化合物种类很多，使用 GC-MS、GC-TEA、HPLC-MS、UPLC-MS/MS 都可以较灵敏的检测多种N-亚硝胺类化合物。因为HPLC-MS、UPLC-MS/MS检测亚硝胺保留时间过长，在大批量检测样品时费时费力，而GC-TEA仪器价格昂贵，所以GC-MS应该是检测N-亚硝胺类化合物仪器首选。不过由于食品样品基质复杂，亚硝胺含量较低，前处理过程中萃取、净化提取亚硝胺比较困难，因此目前亚硝胺的检测分析方法除了要向操作简单、快速、灵敏的方向发展外，还应该大力发展样品在线萃取净化等新技术。

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